N型糖鎖修飾を受けない膜貫通型タンパク質の品質管理に関する研究

不发生N-糖基化的跨膜蛋白的质量控制研究

基本信息

批准号：
11J04413
负责人：
井村祐己
金额：
$ 0.45万
依托单位：
The University of Tokyo
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for JSPS Fellows
财政年份：
2011
资助国家：
日本
起止时间：
2011 至无数据
项目状态：
已结题

项目摘要

ヒトGタンパク質共役型受容体(GPCR)823種についてデータベース検索を行い、その内の53種がN型糖鎖修飾モチーフであるN-x-S/T配列を細胞外領域に有していないことを見出した。その53種のうち42種については、稀に糖鎖修飾が行われるN-x-C配列をも有していないことが判明した。N-x-S/T/Cモチーフを含まないGPCRのうち、ヒトα2Bアドレナリン受容体(ADRa2B)を含む6種類のGPCRに対して遺伝子クローニングを行った。これらを培養細胞株に過剰発現させてウェスタンブロット法(WB)により分子量を測定したところ、構成アミノ酸数から予測される位置にシャープなバンドが確認された。すなわちN-x-S/T/Cモチーフを有していないGPCRが糖鎖修飾を受けていないことを確認した。フローサイトメトリー及び共焦点レーザー顕微鏡を用いてこれらのGPCRの細胞内局在を確認したところ、糖鎖修飾を受けずとも正しく膜発現しているGPCRも存在していることが確認された。膜発現が良好に観察されたADRa2Bについて構造異常型であるC164A(分子内ジスルフィド結合を形成できない変異体)を作製した。C164Aはwtと比較して細胞膜表面への発現が減少しており、小胞体に局在していることが観察された。WBによりそれぞれの定量を行ったところ、C164Aの総タンパク量はwtと比較して減少していた。プロテアソーム阻害剤であるMG132やラクタシスチンで細胞を処理するとこの差がなくなったことから、構造異常型がプロテアソームで分解されていることが示唆された。免疫沈降法によりADRa2Bのユビキチン化を検出したところ、C164Aはwtと比較してよりユビキチン化されていることを見出した。以上の結果から糖鎖修飾を受けないGPCRに対して、(1)糖鎖を介さない小胞体品質管理機構が存在していること(2)構造異常を起こした場合にユビキチン-プロテアソーム系によって分解を行っていることが強く示唆された。

我们对823种人类G蛋白偶联受体（GPCR）进行了数据库检索，发现其中53种在其胞外区域不具有N-x-S/T序列（N型糖基化基序）。结果发现，53个物种中有42个甚至不具有很少进行糖基化的N-x-C序列。对不包含 N-x-S/T/C 基序的六种 GPCR 进行基因克隆，包括人 α2B 肾上腺素受体 (ADRa2B)。当它们在培养的细胞系中过度表达并通过蛋白质印迹（WB）测量它们的分子量时，在根据组成氨基酸的数量预测的位置处观察到清晰的条带。即，确认不具有N-x-S/T/C基序的GPCR不被糖基化。当使用流式细胞术和共聚焦激光显微镜确认这些GPCR的细胞内定位时，证实也存在在膜中正确表达而没有被糖基化的GPCR。我们创建了一种结构异常的 ADRa2B C164A（一种不能形成分子内二硫键的突变体），可以很好地观察到其膜表达。与wt相比，细胞膜表面C164A的表达减少，并且观察到其定位于内质网。当通过 WB 对每种蛋白进行定量时，与 wt 相比，C164A 的总蛋白量有所减少。当细胞用蛋白酶体抑制剂 MG132 和乳胞素处理时，这种差异消失，表明结构异常形式被蛋白酶体降解。当通过免疫沉淀检测ADRa2B的泛素化时，发现C164A比wt更泛素化。上述结果表明，对于不发生糖基化的GPCR，（1）存在不涉及糖链的内质网质量控制机制，（2）当发生结构异常时，它们会被泛素-蛋白酶体系统降解。有人强烈建议这样做。