細胞内mRNP動態解析によるmiRNA翻訳制御メカニズムの解明

通过细胞内 mRNA 动力学分析阐明 miRNA 翻译控制机制

• 批准号: 11J02706
• 负责人: 泉 奈津子
• 金额: $ 1.6万
• 依托单位: The University of Tokyo
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for JSPS Fellows
• 财政年份: 2011
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2011 至 2013
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-11J02706/
• 关键词: miRNA; mRNP

本研究は特定のmRNP (mRNA-タンパク質複合体)を細胞内から精製する手法を確立し、これを用いてmiRM結合によるmRNPの構成変化を解析することにより、miRNA作用機序を解明することを目的としてきた。mRNP精製技術を確立するため、これまでRNP精製タグやレポーターRNAの構造、精製条件など、種々の検討を重ねてきたが、細胞内からのレポーターmRNP回収効率が著しく低いという問題が解決できず、現状ではmRNP構成成分を解析することは困難であると判断した。このため、本年度は並行して進めてきたpiRNA経路の解析に注力した。piRNAは主に生殖系列細胞に発現する24-31塩基長のsmall RNAで、Argonauteファミリーに属するPIWIタンパク質と複合体を形成し、トランスポゾンの発現抑制に機能している。piRNA生成のメカニズムの詳細は未だ不明な点が多いが、長い1本鎖のpiRNA前駆体が、PIWIタンパク質に取り込まれた後、その3'末端が適切な長さまで削られ、2'-0-メチル化修飾を受けることで成熟piRNAがつくられると考えられている。昨年度から、piRNAを介したトランスポゾンの発現抑制への関与が示唆されていたHsp90シャペロンのpiRNA生成における役割を明らかにするために、Hsp90の活性阻害によるpiRNA経路への影響をin vivo、in vitroの両面から解析してきた。その結果、Hsp90がPIWIタンパク質を安定化し、piRNA前駆体のPIWIタンパク質への正しい取り込みを促進していることを明らかにした。また、本年度はPIWIタンパク質に取り込まれたpiRNA前駆体の3'末端のトリミングを担う未知のヌクレアーゼTrimmerの同定を目指した解析を進めた。Trimmerは細胞不溶性画分に存在し、その活性を可溶化することが困難なため、これまで生化学的に同定することができなかった。この問題を解決するため、様々な活性抽出条件の検討および最適化を行った結果、一部のトリミング活性を可溶化できる条件を見出すことに成功した。

这项研究已经建立了一种从细胞内纯化特定的MRNP（mRNA-蛋白复合物）的方法，并使用它来分析由于MIRM结合而导致的MRNP的组成型变化，从而阐明了miRNA作用的机理。为了建立MRNP纯化技术，已经进行了各种研究，包括RNP纯化标签和报告基因RNA的结构以及纯化条件，但是尚未解决记者MRNP从细胞内的极低效率的问题，并且尚未确定目前很难分析MRNP组成部分。因此，今年我们专注于分析我们一直在并行处理的PIRNA途径。 PIRNA是一种小的RNA，长度为24-31个核苷酸，主要在生殖细胞中表达，并具有属于Argonaute家族的PIWI蛋白质的复合物，并且可以抑制转座子表达的功能。尽管PIRNA产生机理的细节尚不清楚，但据信，在长长的单链PIRNA前体掺入PIWI蛋白之后，将3'端削减至适当的长度，并进行了2'-0-0-甲基化修饰，可以产生成熟的PIRNA。自去年以来，为了阐明HSP90伴侣在PIRNA产生中的作用，这被认为参与通过PIRNA抑制转座子的表达，我们分析了抑制HSP90活性对来自体内和体外体外和体外的PIRNA途径的影响。结果表明，HSP90稳定PIWI蛋白，并促进PIRNA前体对PIWI蛋白的正确摄取。此外，今年我们进行了分析，旨在识别未知的核酸酶修剪器，该修剪器负责修剪掺入PIWI蛋白的Pirna前体的3'端。 Trimmer以前无法在生物化学上识别，因为它存在于细胞不溶性部分中，并且很难溶解其活性。为了解决此问题，检查和优化了各种活动提取条件，因此，我们成功发现了可以溶解一些修剪活性的条件。

项目成果

Heat shock protein 90 regulates phosphatidylinositol 3-kinase-related protein kinase family proteins together with the RUVBL1/2 and Tel2-containing co-factor complex

• DOI: 10.1111/j.1349-7006.2011.02112.x
• 发表时间: 2012-01-01
• 期刊: CANCER SCIENCE
• 影响因子: 5.7
• 作者: Izumi, Natsuko;Yamashita, Akio;Ohno, Shigeo
• 通讯作者: Ohno, Shigeo

Recognition of the pre-miRNA structure by Drosophila Dicer-1

• DOI: 10.1038/nsmb.2125
• 发表时间: 2011-10-01
• 期刊: NATURE STRUCTURAL & MOLECULAR BIOLOGY
• 影响因子: 16.8
• 作者: Tsutsumi, Akihisa;Kawamata, Tomoko;Tomari, Yukihide
• 通讯作者: Tomari, Yukihide