新規分子ディスプレイ技術を用いた二重特異性抗体の開発

利用新型分子展示技术开发双特异性抗体

• 批准号: 11J02677
• 负责人: 住田 壮
• 金额: $ 0.83万
• 依托单位: Keio University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for JSPS Fellows
• 财政年份: 2011
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2011 至 2012
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-11J02677/
• 关键词: エマルジョンPCR; mRNAディスプレイ法; Fab抗体; タンパク質/RNA複合体

本研究では,まず,エマルジョンPCRとmRNAディスプレイ法を組み合わせた手法でFabライブラリーから目的の抗体が取得されるかどうかの確認を行った.前年度,モデルとして抗p53Fabにランダム変異を導入したライブラリーから結合活性が上昇した変異体を取得することを目指した結果,野生型より高い結合活性が持つ変異体を取得することができた.今年度は,得られた変異体の解離定数の算出や変異の影響などの詳細な解析を行い,研究成果をまとめた.次に,分子センサーとして機能する二重特異性抗体の元となる抗体を作製した.前年度に作製した抗CEA抗体を基にCEAとフルオレセインを認識する抗体の変異体ライブラリーを作製した.H鎖を抗CEA由来,L鎖を抗フルオレセイン由来のキメラ抗体をまず作製し,そのキメラ抗体を基にエラープローンPCRによってランダム変異を導入することで変異体ライブラリーを作製した,現在は,前年度に作製したエストラジオールとフルオレセインのキメラ抗体の変異体ライブラリーと共に,分子センサーとして機能する二重特異性抗体のセレクションを試みている.また,エマルジョンPCRとmRNAディスプレイ法を組み合わせたセレクション手法を発展させることによって,新たにタンパク質/RNA複合体のセレクション系の構築に着手した.タンパク質C5とRNA M1の複合体である大腸菌RNasePをモデルとして系の確立を目指した,まず,mRNAディスプレイされたC5とM1の複合体がtRNA前駆体に結合し,5'側を切断してRNasePの機能を有することを確認した.次いで,C5に結合するアプタマーであるW2がmRNAディスプレイされたC5と結合することを確認した.C5/W2の複合体をネガティブコントロールとして用いたところ,C5/M1複合体をアフィニティセレクションによって100倍以上濃縮することができた.

在本研究中，我们首先使用乳液PCR和mRNA展示相结合的方法确认是否可以从Fab文库中获得所需的抗体。结果，我们的目标是从集合体中获得结合活性增强的突变体。比野生型具有更高的结合活性。我们能够获得具有更高结合活性的突变体。今年，我们对获得的突变体的解离常数的计算以及突变的影响进行了详细的分析，并总结了研究结果。接下来，我们创建了一个。该抗体是作为分子传感器发挥作用的双特异性抗体的基础。它基于前一年创建的抗 CEA 抗体来识别 CEA 和荧光素。我们创建了抗体突变体库，首先创建了具有源自抗CEA的H链和源自抗荧光素的L链的嵌合抗体，然后通过基于嵌合抗体的易错PCR引入随机突变来创建突变体。我们已经创建了一个库，目前正在使用我们去年创建的雌二醇和荧光素的嵌合抗体。我们正在尝试与突变体库一起选择作为分子传感器的双特异性抗体。此外，通过开发结合乳液PCR和mRNA展示的选择方法，我们正在开发用于检测蛋白质/RNA复合物的新方法，开始构建选择。系统.蛋白质C5和RNA我们的目的是建立一个使用大肠杆菌 RNaseP（M1 复合物）作为模型的系统，首先，mRNA 展示的 C5 和 M1 复合物与 tRNA 前体结合，切割 5' 侧，并具有该功能。接下来，我们确认了 RNaseP 与 C5 的结合。我们确认适体 W2 与 mRNA 展示的 C5 结合。当我们使用 C5/W2 复合物作为阴性对照时，我们能够通过亲和力选择将 C5/M1 复合物富集 100 倍以上。