新規分子ディスプレイ技術を用いた二重特異性抗体の開発

利用新型分子展示技术开发双特异性抗体

• 批准号: 11J02677
• 负责人: 住田 壮
• 金额: $ 0.83万
• 依托单位: Keio University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for JSPS Fellows
• 财政年份: 2011
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2011 至 2012
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-11J02677/
• 关键词: エマルジョンPCR; mRNAディスプレイ法; Fab抗体; タンパク質/RNA複合体

本研究では,まず,エマルジョンPCRとmRNAディスプレイ法を組み合わせた手法でFabライブラリーから目的の抗体が取得されるかどうかの確認を行った.前年度,モデルとして抗p53Fabにランダム変異を導入したライブラリーから結合活性が上昇した変異体を取得することを目指した結果,野生型より高い結合活性が持つ変異体を取得することができた.今年度は,得られた変異体の解離定数の算出や変異の影響などの詳細な解析を行い,研究成果をまとめた.次に,分子センサーとして機能する二重特異性抗体の元となる抗体を作製した.前年度に作製した抗CEA抗体を基にCEAとフルオレセインを認識する抗体の変異体ライブラリーを作製した.H鎖を抗CEA由来,L鎖を抗フルオレセイン由来のキメラ抗体をまず作製し,そのキメラ抗体を基にエラープローンPCRによってランダム変異を導入することで変異体ライブラリーを作製した,現在は,前年度に作製したエストラジオールとフルオレセインのキメラ抗体の変異体ライブラリーと共に,分子センサーとして機能する二重特異性抗体のセレクションを試みている.また,エマルジョンPCRとmRNAディスプレイ法を組み合わせたセレクション手法を発展させることによって,新たにタンパク質/RNA複合体のセレクション系の構築に着手した.タンパク質C5とRNA M1の複合体である大腸菌RNasePをモデルとして系の確立を目指した,まず,mRNAディスプレイされたC5とM1の複合体がtRNA前駆体に結合し,5'側を切断してRNasePの機能を有することを確認した.次いで,C5に結合するアプタマーであるW2がmRNAディスプレイされたC5と結合することを確認した.C5/W2の複合体をネガティブコントロールとして用いたところ,C5/M1複合体をアフィニティセレクションによって100倍以上濃縮することができた.

在这项研究中，我们首先确认了使用乳液PCR和mRNA显示方法的组合从FAB库中获得了靶抗体。在上一年，我们的目的是从文库中获得具有增加结合活性的突变体，其中将随机突变引入抗P53FAB作为模型，因此，我们能够获得比野生型具有更高结合活性的突变体。今年，我们对获得的突变体的解离常数和突变的效果进行了详细分析，并汇总了研究结果。接下来，我们创建了一种用作分子传感器的抗体。基于上一年产生的抗CEA抗体识别CEA和荧光素。我们创建了一个抗体突变体的库。我们首先创建了一种源自抗CEA和L链的抗荧光素的嵌合抗体，并通过使用误解PCR的嵌合抗体引入随机突变来创建突变库。还开始通过开发一种结合乳液PCR和mRNA显示方法的选择方法来构建蛋白质/RNA复合物的新选择系统。蛋白C5和RNA我们旨在使用M1复合物大肠杆菌RNASEP建立系统。首先，我们证实了与tRNA前体结合的mRNA播放的C5和M1复合物，并裂解了5'侧以具有rnasep的功能。然后，我们确认W2是与C5结合的适体，与mRNA-Display的C5结合。当将C5/W2复合物用作阴性对照时，C5/M1复合物可以通过亲和力选择超过100倍来集中。