腎臓特異的薬物輸送蛋白OATP-Rのノックアウトマウスの作製と生体内機能の解明

肾脏特异性药物转运蛋白OATP-R敲除小鼠的产生及其体内功能的阐明

基本信息

批准号：
17790347
负责人：
鈴木健弘
金额：
$ 2.24万
依托单位：
Tohoku University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Young Scientists (B)
财政年份：
2005
资助国家：
日本
起止时间：
2005 至 2006
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-17790347/
关键词：
トランスレーショナルリサーチ遺伝子薬理学

项目摘要

研究の目的研究代表者が単離したOATP-Rは腎尿細管上皮細胞の血管側に発現する有機アニオントランスポーターであり、腎臓での薬剤や腎不全物質の排泄を担う分子である。本研究では、OATP-RノックアウトマウスをCre recombinnaseを用いたconditional gene targetingで作製し、機能喪失モデルでOATP-Rの生体内機能の解析を行い、さらに腎不全モデル、薬剤性腎障害モデルをノックアウトマウスで作製し、その病態における変化を検討することを目的とする。ノックアウトコンストラクトの作製マウスOATP-Rはマウス第一染色体上に13個のexonが約50kbに渡って分布している。この第4番目のexon(以下Ex4)をノックアウトするためのGene Targeting vectorの作製を行った。Gene Targeting vectorの構造はEx4を挟み、その5'側のintronにloxP配列を、3'側のintronにES細胞への導入時のpositive selectionのためのneomycin耐性遺伝子の両端にloxP配列を配置してある、loxP-neo-loxpカセットを挿入し、Cre recombihaseによるEx4のdeletionを行うようにし、また相同組換えのために5'側に約8.8kbのlonga arm、3'側に1.2kbのshort armとなるマウスOatp-Rのgenomic DNAを配置する設計とした。実際にノックアウトマウスを作製する系統である、129SVJ mice strainのgenomic libraryをEx4を含むDNAプローブを用いた方法でスクリーニングしEx4の5'側、3'側とも約10kbを含むgenomic DNAのクローンを単離し、さらに適切な制限酵素で切り出した断片をpBluescript-SK(+) plasmidへサブクローニングした。loxP配列の挿入上問題となる、intron上のcis elementを避けるため、同部位のintronの塩基配列をsequenceで確認の上(NIH等のマウスゲノムDNAのデータベースにあるC57BL/6 strainと比較すると、129SVJ strainではintron部分の塩基配列はsequenceを行った約3000bpの部位のみでも全体の1.4%程で塩基の置換や欠失等の相違があった)、loxP配列挿入部位を決定した。現役Gene Targetinng vectorが完成し、今後ES細胞への導入とノックアウトマウス系列の樹立の段階へと研究を進めていく予定である。

研究目的主要研究者分离出的OATP-R是肾小管上皮细胞血管侧表达的有机阴离子转运蛋白，是负责肾脏内药物和肾衰竭物质排泄的分子。在本研究中，我们利用Cre重组酶条件基因打靶产生了OATP-R敲除小鼠，分析了OATP-R在功能丧失模型中的体内功能，并敲除了肾衰竭模型和药物性肾损伤模型目的是在小鼠中制造它并检查其病理变化。敲除构建体的创建小鼠 OATP-R 有 13 个外显子，分布在第一条小鼠染色体上约 50 kb 上。创建基因打靶载体来敲除该第四外显子（下文中称为Ex4）。 Gene Targeting载体的结构是将Ex4夹在中间，在5'内含子中放置loxP序列，在新霉素抗性基因两端的3'内含子中放置loxP序列，以便导入ES细胞时进行正选择。 loxP-neo-loxp盒，通过Cre重组酶删除Ex4，并在5'侧添加约8.8kb的longa进行同源重组。其设计是，将小鼠 Oatp-R 的基因组 DNA 放置在臂的 3' 侧，形成 1.2 kb 的短臂。我们使用含有Ex4的DNA探针筛选了129SVJ小鼠品系的基因组文库，该品系是实际用于创建基因敲除小鼠的品系，并单独分离了5'和3'上均含有约10 kb的基因组DNA克隆。将片段分离并用适当的限制性酶切下并亚克隆到pBluescript-SK(+)质粒中。为了避免插入loxP序列时出现内含子上的顺式元件问题，我们检查了与序列相同位点的内含子核苷酸序列（与NIH小鼠基因组DNA数据库中的C57BL/6品系进行比较）等）129SVJ在该菌株的内含子部分的核苷酸序列中，约3000bp的整个测序部分的约1.4％存在核苷酸取代和缺失等差异，并且确定了loxP序列的插入位点。目前基因打靶载体已经完成，我们计划将研究推进到将其导入ES细胞并建立敲除小鼠系的阶段。