潜在する微生物テルペノイドの発掘及び新型テルペン環化酵素遺伝子の取得

潜在微生物萜类化合物的发现和新萜环化酶基因的获得

基本信息

批准号：
17780088
负责人：
佐藤努
金额：
$ 2.3万
依托单位：
Niigata University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Young Scientists (B)
财政年份：
2005
资助国家：
日本
起止时间：
2005 至 2006
项目状态：
已结题

项目摘要

生合成研究:Mycobacterium chlorophenolicumから単離されたC_<35>環状テルペンはZ型のC_<35>直鎖状ポリプレニルニリン酸の環化反応によって生合成されると予想している。それを支持する証拠を得るため、市販の安価な試薬から容易に合成できる短鎖のC_<10>とC_<15>のポリプレニルニリン酸を基質として用いて無細胞抽出液と反応させた。E型のC_<10>ポリプレニルニリン酸は反応しなかったのに対し、Z型はC_<35>環状テルペンの部分構造と類似したリモネンを生成した。また、ω.E.E体のC_<15>のポリプレニルニリン酸も反応せず、ω, Z, Zで体は環化反応した。これらの結果は、Z型のポリプレニルニリン酸にのみ基質特異性をもつテルペン環化酵素が存在することを示していた。現在知られているテルペン環化酵素はE型を天然基質とするものだけであることから、新規性の高いテルペン環化酵素が存在していることが示唆された。遺伝子クローニング:昨年度までに2つのZ型プレニルトランスフェラーゼ遺伝子の一部を縮重プライマーによってクローニングしていた。今年度、染色体歩行によって上・下流の塩基配列を読み進んだ。高いGC含量の影響等により容易に読める配列ではなかったが、様々なシーケンス反応の条件を検討し改良した結果、Z型プレニルトランスフェラーゼ遺伝子の全長を読むことができた.現在、更に上・下流を読むことによってC_<35>環状テルペン生合成酵素の候補遺伝子を探している.また、2つのZ型プレニルトランスフェラーゼの生成物を同定するため、pET系ベクターで発現させる実験を進行した。

生物合成研究：从氯酚分枝杆菌中分离得到的C_35环状萜有望通过Z型C_35直链聚异戊二烯二磷酸酯的环化反应来生物合成。为了获得支持证据，我们使用短链C_10和C_15聚异戊二烯基二磷酸作为底物，并使其与无细胞提取物反应，该短链C_10和C_15聚异戊二烯基二磷酸可以很容易地由廉价的市售试剂合成。 E型的C_10聚异戊二烯基磷酸不发生反应，而Z型则产生部分结构与C_35环状萜烯相似的柠檬烯。此外，ω.E.E形式的C_ 15 聚异戊二烯基二磷酸不发生反应，而ω、Z和Z形式发生环化反应。这些结果表明存在仅对Z型聚异戊二烯二磷酸具有底物特异性的萜烯环化酶。目前已知的唯一萜烯环化酶使用E型作为天然底物，这表明存在一种高度新颖的萜烯环化酶。基因克隆：直到去年，我们还使用简并引物克隆了两个Z型异戊二烯转移酶基因的部分内容。今年，我们通过遍历染色体来读取上游和下游碱基序列。虽然由于高GC含量的影响，序列不易读取，但经过研究和改进各种测序反应条件，我们已经能够读取Z型异戊二烯转移酶基因的全长。目前，我们正在进一步上游研究我们正在通过阅读寻找C_<35>环萜生物合成酶的候选基因。此外，为了鉴定两种Z型异戊烯基转移酶的产物，我们进行了在基于pET的载体中表达它们的实验。