新規テルペン環化酵素の微生物ゲノムからの発掘

从微生物基因组中发现一种新型萜烯环化酶

基本信息

批准号：
15780083
负责人：
佐藤努
金额：
$ 2.3万
依托单位：
Niigata University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Young Scientists (B)
财政年份：
2003
资助国家：
日本
起止时间：
2003 至 2004
项目状态：
已结题

项目摘要

本研究では、ゲノム解析から見出された推定のテルペン環化酵素の機能解析を行い、新規環状骨格を形成する環化酵素の発見につなげることを目的としている。本年度において、すでにクローニングと大腸菌における発現を達成している結核菌Mycobacterium tuberculosis由来の推定環化酵素について研究を進めた。基質はゲラニルゲラニル2リン酸であることが判明していたが、生成物の構造は確定していなかった。そこで、単離・精製し、MS及びNMRによって構造解析したところ、今までに見出されていないハリマン骨格のジテルペン(二リン酸体)であることが解った。他のミコバクテリア属にも新規テルペンが存在するのではないかと予想し、Mycobacterium smegmatisの炭化水素成分のGC-MS分析を行ってみた。その結果、新規物質の可能性がある2種類の脂質を見出すことができた。大量培養後、各種クロマトグラフィーによって単離・精製した。MS及びNMRによって構造解析したところ、両者ともC_<35>の単環性の炭化水素であることが判明した。構造からヘプタプレニル二リン酸の二リン酸脱離から開始する環化反応によって生合成されることが推測される。我々の知る限り、このようなC_<35>テルペン類の報告はなく、天然物として初めての例ではないかと考えている。スクアレン環化酵素の研究も同時に進めた。変異型酵素を機能解析し、反応最終段階の脱プロトン化の触媒機構について新たな知見を得ることができた。また、原核生物のスクアレン環化酵素を真核生物由来トリテルペン環化酵素型(Gly600欠損型酵素)の基質特異性へ改変することに成功した。

在这项研究中，我们将对通过基因组分析发现的假定的萜烯环化酶进行功能分析，目的是发现一种形成环状骨架的新环化酶。今年，我们对源自结核分枝杆菌的假定环化酶进行了研究，该酶已在大肠杆菌中克隆并表达。发现底物是香叶基香叶基二磷酸，但产物的结构尚未确定。因此，经过分离纯化，并通过MS和NMR进行结构分析，发现它是一种以前从未发现过的具有Harriman骨架的二萜（二磷酸）。预计其他分枝杆菌属中可能存在新的萜烯，我们对耻垢分枝杆菌的烃成分进行了 GC-MS 分析。结果，他们发现了两种有可能成为新物质的脂质。大量培养后，通过各种层析方法进行分离纯化。 MS和NMR的结构分析表明两者都是C_ 35 单环烃。从结构推测，它是通过从庚烯基二磷酸消除二磷酸开始的环化反应而生物合成的。据我们所知，还没有此类C_<35>萜烯的报道，我们相信这是此类C_<35>萜烯作为天然产物的第一个例子。与此同时，角鲨烯环化酶的研究也取得进展。通过对突变酶进行功能分析，我们获得了有关反应最后一步去质子化催化机制的新知识。我们还成功地将原核角鲨烯环化酶的底物特异性修饰为真核三萜环化酶类型（Gly600 缺陷酶）。