温度応答性培養皿への遺伝子固定化と熱刺激による界面からのデリバリー制御

基因固定在温度响应培养皿上并使用热刺激控制界面的递送

• 批准号: 16700369
• 负责人: 武田 直也
• 金额: $ 2.37万
• 依托单位: Waseda University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Young Scientists (B)
• 财政年份: 2004
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2004 至 2005
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-16700369/
• 关键词: 遺伝子導入; 温度応答性; 高分子; 界面; 細胞基底面

温度に応答して相転移を起こすN-isopropylacrylamide(IPAAm)を主として、カチオン性と疎水性の3つのユニットからなる直鎖状のランダム共重合体(IP-20D-10B)について、293細胞に対する遺伝子導入効率を評価した。導入する遺伝子には、GFPをコードしたプラスミドDNAを用いた。まず定法の培地に添加する方法でIP-20D-10B/DNA複合体を293細胞に加えた所、confluentで細胞分裂が抑制された状態であっても40%程度(t=4d)の高い遺伝子導入効率が得られた。続いて、IPAAmにカルボキシル基を導入した誘導体(CIPAAm)を合成し、IPAAmとCIPAAmを培養基材表面に電子線でグラフトして、温度応答性培養皿を作製した(CIPAAmのモル分率は1,3,5%)。ここに、正電荷過剰のIP-20D-10B/DNA複合体を静電的に固定し、さらに293細胞を播種して細胞の基底面からの遺伝子導入を試みた。CIPAAmのモル比の増大に伴って細胞接着性が低下し、5%CIPAAm培養皿では培養1日目で細胞の凝集が観測された。遺伝子の導入効率は、0、01%以下ときわめて低かった。そこで、接着性の強いretinal pigment epithelial cellに細胞種を変えて同様に検討を行なったが、遺伝子導入はほとんど観察されなかった。しかしながら、IPAAm/CIPAAm温度応答性培養皿では、IPAAm単独の培養皿と比較して温度変化による細胞の回収が容易となることが見出された。本研究における細胞培養表面へのDNAの固定化量は、産総研の遺伝子導入アレイやNorth western Univ.のSheaらと比較して、1/10〜1/100であった。よって、遣伝子導入効率の改善にはDNA固定:量の増大が必要と考えられる。

主要由 N-异丙基丙烯酰胺 (IPAAm) 和三个阳离子和疏水单元组成的线性无规共聚物 (IP-20D-10B) 在 293 个电池上进行了测试，并评估了其执行效率。使用编码GFP的质粒DNA作为待导入的基因。首先，当我们将IP-20D-10B/DNA复合物添加到293细胞中时，将其添加到标准培养基中，我们发现即使在汇合细胞中细胞分裂受到抑制，基因表达率也增加了约40%（t =4d)。接下来，合成在IPAAm中引入羧基的衍生物（CIPAAm），并使用电子束将IPAAm和CIPAAm接枝到培养基表面，制作温度响应型培养皿（CIPAAm的摩尔分数）为 1 ,3,5%）。此处，带正电荷的IP-20D-10B/DNA复合物被静电固定，并进一步接种293个细胞以尝试从细胞基底表面导入基因。随着CIPAAm摩尔比的增加，细胞粘附力下降，培养第一天5%CIPAAm培养皿中即可观察到细胞聚集。基因转移效率极低，不到0.01%。因此，使用具有很强粘附性的视网膜色素上皮细胞进行了类似的研究，但几乎没有观察到基因转移。然而，我们发现，与仅使用 IPAAm 的培养皿相比，IPAAm/CIPAAm 温度响应型培养皿更容易因温度变化而回收细胞。本研究中固定在细胞培养表面的DNA量是AIST基因转移阵列和西北大学Shea等人的1/10至1/100。因此，认为有必要增加DNA的固定量以提高基因导入效率。