インビトロタンパク質合成系を用いたリポソーム-細胞間ギャップ結合の形成とその応用

利用体外蛋白质合成系统形成脂质体-细胞间隙连接及其应用

基本信息

批准号：
05J52342
负责人：
金田誠
金额：
$ 1.73万
依托单位：
Tokyo Medical and Dental University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for JSPS Fellows
财政年份：
2005
资助国家：
日本
起止时间：
2005 至 2007
项目状态：
已结题

项目摘要

リポソームを用いた薬剤導入法の効率の低さや細胞毒性などの問題点を解決するため、インビトロタンパク合成系を用いて、ギャップ結合(GJ)の構成タンパク質であるコネキシン43(Cx43)をリポソーム内で発現させることにより作成したCx43発現リポソームの機能解析、および実用化への応用研究を行っている。このリポソームから培養細胞への物質導入効率を検討するため、リポソームを作成時にカルセインを加え、内部にカルセインを含むCx43発現リポソームを作成し、これをCx43発現細胞に添加した。添加2時間後、リポソームから細胞へのカルセインの移行が認められた。同様に、この系を用いてNF-κBシグナルを阻害するオリゴペプチドを培養細胞に投与したところIL-1β刺激に伴うNF-κBプロモーター活性の上昇、およびCyclooxygenase-2のmRNA発現量の上昇を優位に抑制した。これらの物質移行はCx43を発現していないリポソームやギャップ結合の阻害剤を前処理した場合には認められなかったことから、Cx43発現リポソームの投与によりリポソーム-細胞間に機能的なギャップ結合が形成されることが示唆された。さらに、Cxの別のサブタイプであるCx32を同様に発現させたリポソームで蛍光物質導入実験を行ったところ、Cx32発現培養細胞に対しては物質輸送が認められたのに対し、Cx43発現培養細胞に対してはそのような効果が認められなかった。Cxタンパク質には約20種類のサブタイプが存在し、発現パターンには組織特異性がある。したがって、本研究結果は将来的にvitroやvivoにおける組織・細胞選択的な薬剤導入への可能性を高めるものであり、今後さらに実用化に向け研究を継続する。

为了解决使用脂质体的药物递送方法的低效率和细胞毒性等问题，我们使用体外蛋白质合成系统将间隙连接（GJ）的组成蛋白连接蛋白43（Cx43）注射到脂质体中。对表达Cx43而制成的表达Cx43的脂质体进行功能分析，并进行实用化的应用研究。为了检查物质从该脂质体导入培养细胞的效率，在制作脂质体时添加钙黄绿素，制作内部含有钙黄绿素的表达Cx43的脂质体，并将其添加到表达Cx43的细胞中。添加后两小时，观察到钙黄绿素从脂质体转移至细胞。同样，当使用该系统将抑制 NF-κB 信号的寡肽施用到培养细胞时，它们显着增加了 NF-κB 启动子活性，并且在 IL-1β 刺激后抑制了 Cyclooxygenase-2 mRNA 表达。在不表达 Cx43 的脂质体中或在用间隙连接抑制剂预处理时没有观察到这些物质转移，这表明通过施用表达 Cx43 的脂质体在脂质体和细胞之间形成功能性间隙连接。此外，当我们使用同样表达Cx32（Cx的另一种亚型）的脂质体进行荧光物质引入实验时，我们发现在表达Cx32的培养细胞中观察到物质转运，而在表达Cx43的培养细胞中没有观察到这种效果。 Cx 蛋白大约有 20 种亚型，它们的表达模式具有组织特异性。因此，本研究的结果增加了未来在体外和体内引入组织和细胞选择性药物的可能性，我们将继续我们的研究以实现进一步的实际应用。