網膜コリン作動性ニューロンで発見された新奇なアセチルコリン合成経路の検討

检查视网膜胆碱能神经元中发现的新型乙酰胆碱合成途径

基本信息

批准号：
20K09836
负责人：
金田誠
金额：
$ 2.75万
依托单位：
Nippon Medical School
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
财政年份：
2020
资助国家：
日本
起止时间：
2020-04-01 至 2024-03-31
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-20K09836/
关键词：
プリン受容体アセチルコリンコリン retina acetylcholine purinoceptor

项目摘要

P2X2-RとGFPを強制発現させたHEK細胞を、コリン溶液中でインキュベートし、ATPを添加するとコリン取り込みが増加することはHPLCを用いた実験で確認済みである（Ishii …Kaneda 2017 J. Neurophysiol.）。令和３年度までに実施した研究で、ACh合成能を高めたHEK細胞株では、高濃度コリン溶液中でP2X2-Rを強制発現させたHEK細胞にATPを作用させると、流入したコリンからAChが産生されることはHPLC法で確認することが出来た。そこでACh合成能を高めるなどの遺伝子操作を加えていない通常のHEK細胞を用いて、同様の検討を進めた。通常のHEK細胞を用いた検討では、できるだけ生理的条件に近い状況でAChの合成が起こるかどうかを検討する目的で、細胞外液中のコリン濃度を下げた生理的濃度のコリンを含む溶液中でも実験を行った。その結果、生理的濃度のコリン溶液中では、通常のHEK細胞を用いてATP投与時にみられるACh合成量の増加をHPLCで検出することは難しいと判断せざるを得ない結果が得られた。令和４年度は、ACh合成能を高めたHEK細胞株を使って、生理的濃度のコリン溶液中でATP刺激で細胞内に流入したコリンからのACh合成量を計測する実験を実施した。その結果、生理的濃度のコリン溶液中でもATPを作用させることで、P2X2-Rを通じてコリンが細胞内に流入し、その結果AChの合成が増加することが証明できた。また論文化に必要な様々な基礎的な追加実験を実施した。ここまでの研究成果を日本生理学会、日本神経科学学会の年次大会で報告し、その成果をまとめて投稿した。

使用 HPLC 的实验已证实，当强制表达 P2X2-R 和 GFP 的 HEK 细胞在胆碱溶液中孵育并添加 ATP 时，胆碱摄取会增加（Ishii …Kaneda 2017 J. Neurophysiol）。在截至 2021 财年进行的研究中，发现当 ATP 应用于在高浓度胆碱中被迫表达 P2X2-R 的 HEK 细胞时，ACh 合成能力增强的 HEK 细胞系能够从胆碱流入中吸收 ACh通过HPLC方法确认溶液的产生。因此，我们使用未经过基因改造以提高其乙酰胆碱合成能力的常规 HEK 细胞进行了类似的研究。在使用正常HEK细胞的研究中，为了检查ACh合成是否在尽可能接近生理条件的条件下发生，我们使用含有生理浓度胆碱的溶液进行了实验，并且降低了细胞外液中胆碱的浓度。一个实验。因此，我们被迫得出这样的结论：当使用生理浓度的胆碱溶液中的正常 HEK 细胞施用 ATP 时，很难通过 HPLC 检测到 ACh 合成的增加。 2020财年，我们使用乙酰胆碱合成能力增强的HEK细胞系，进行了一项实验，测量在生理浓缩胆碱溶液中经ATP刺激后流入细胞的胆碱合成的乙酰胆碱量。结果，我们能够证明，即使在生理浓缩的胆碱溶液中，通过作用于 ATP，胆碱也会通过 P2X2-R 流入细胞，导致 ACh 合成增加。我们还进行了论文发表所需的各种基本附加实验。迄今为止的研究成果已在日本生理学会和日本神经科学学会的年会上进行了报告，并对结果进行了总结和发布。