新規な生分解性キトサンナノ粒子を用いた高機能ワクチンの開発

使用新型可生物降解壳聚糖纳米粒子开发高功能疫苗

基本信息

批准号：
05F05133
负责人：
明石満
金额：
$ 0.77万
依托单位：
Osaka University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for JSPS Fellows
财政年份：
2005
资助国家：
日本
起止时间：
2005 至 2006
项目状态：
已结题

项目摘要

キトサンは、自然界に存在する多糖類の中でセルロースの次に多く存在し、生体適合性や生分解性などバイオマテリアルとして適した性質を有している。これまで、創傷被覆剤やドラッグキャリアなど様々な生体材料へ応用されてきたが、キトサンの自己組織化によるナノ構造体の形成と制御に関する詳細な検討は行われていない。そこで本研究では、親水性多糖であるキトサンに疎水性のフェニルアラニンを結合し、親・疎水性のバランスを制御することによるナノ構造体の形成を目的とした。さらに、ナノ構造体の制御によるDDS・ワクチン担体としての応用を目標に設定した。加水分解処理により低分子化することで水溶性を付与したオリゴキトサン(脱アセチル化度=83%、分子量=3,320)のアミノ基に、縮合剤であるEDCを用いてフェニルアラニンを結合した。反応はFT-IRや^1H-NMRスペクトル、X線回折測定により確認した。合成したキトサン誘導体は水溶性を示した。キトサン誘導体を水に溶解させてアセトンに添加することで、アセトンの色が乳白色に変化した。この溶液を乾燥した後に走査型電子顕微鏡(SEM)で観察した結果、フェニルアラニンの導入率によって粒径50〜80nmの粒子状の凝集体から平均50〜150nmの大きさのロッド状へと構造が変化することが確認された。これは、フェニルアラニンの導入率に伴った親・疎水性のバランスで構造体の形状が変化したと考えている。調製したキトサン-g-フェニルアラニンナノ粒子のDNAキャリアへの応用を目的としてサケ精子由来DNAとのコンプレックス形成を検討した結果、複数のナノ粒子がDNAとコンプレックスを形成することがDLSによる粒径測定、DNA染色による蛍光顕微鏡観察、SEM観察により明らかとなった。また、コンプレックスからのDNAの徐放について検討した結果、塩基性緩衝液中(pH=9.5)では3日以内にすべてのDNAが徐放されたが、酸性・中性緩衝液中(pH=3,7.4)では44日後においてもすべてのDNAが徐放されないことが確認された。さらに、キトサンナノ粒子、ナノ粒子-DNAコンプレックスの細胞毒性を調べた結果、細胞毒性を示さず安全性の高いDNAキャリアであることが明らかとなった。以上のように、キトサン誘導体の親・疎水性を制御することで、ナノ粒子からロッド状構造体までキトサンの自己組織化の制御に初めて成功し、安全性の高い新規なDNAキャリアとして有用であることを見出した。本研究の成果は国際学会のプロシーディングスに受理されており、またアメリカ化学会Biomacromolecules誌に現在投稿中である。

壳聚糖是自然界中仅次于纤维素的第二丰富的多糖，并且具有适合作为生物材料的特性，例如生物相容性和生物可降解性。迄今为止，它已应用于伤口敷料、药物载体等多种生物材料，但尚未对通过壳聚糖自组装形成和控制纳米结构进行详细研究。因此，在本研究中，我们的目标是通过将疏水性苯丙氨酸与亲水性多糖壳聚糖结合并控制母体和疏水性之间的平衡来形成纳米结构。此外，目标是通过控制纳米结构将其用作 DDS/疫苗载体。苯丙氨酸与使用缩合剂 EDC 进行水解处理、降低分子量而变成水溶性的壳寡糖（脱乙酰度 83%、分子量 3,320）的氨基结合。通过FT-IR、 1 H-NMR光谱和X射线衍射测量证实了该反应。合成的壳聚糖衍生物显示出水溶性。将壳聚糖衍生物溶解在水中，加入到丙酮中，丙酮的颜色变成乳白色。干燥该溶液后，我们用扫描电子显微镜（SEM）对其进行观察，发现结构从粒径为50至80 nm的粒状聚集体转变为平均尺寸为50至150 nm的棒状颗粒，具体取决于已确认苯丙氨酸的引入率。这被认为是由于与苯丙氨酸的引入速率相关的亲子性和疏水性的平衡导致结构形状的变化。为了将制备的壳聚糖-g-苯丙氨酸纳米颗粒用作DNA载体，研究与鲑鱼精子来源的DNA形成复合物，结果发现多个纳米颗粒与DNA形成复合物，这是通过粒径测量确定的这是通过使用 DNA 染色的荧光显微镜观察和 SEM 观察来揭示的。此外，检查复合物中DNA的持续释放的结果是，所有DNA在碱性缓冲液(pH = 9.5)中持续释放，但在酸性/中性缓冲液(pH = 3, 7.4)中持续释放。经证实，即使在 44 天后，并非所有 DNA 都持续释放。此外，通过对壳聚糖纳米颗粒和纳米颗粒-DNA复合物的细胞毒性进行检查，结果表明它们是不具有细胞毒性的高度安全的DNA载体。如上所述，通过控制壳聚糖衍生物的亲和力和疏水性，我们首次成功控制了壳聚糖从纳米颗粒到棒状结构的自组装，我发现这可作为一种新型且高度安全的DNA载体。那。这项研究的结果已被国际会议录接受，目前正在提交给美国化学会的期刊《生物大分子》。