コレステロール排出に関与するABCタンパク質の機能解析

参与胆固醇流出的 ABC 蛋白的功能分析

基本信息

批准号：
16770095
负责人：
松尾道憲
金额：
$ 2.18万
依托单位：
Kyoto University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Young Scientists (B)
财政年份：
2004
资助国家：
日本
起止时间：
2004 至 2005
项目状态：
已结题

项目摘要

複数のABCタンパク質(ABCA1,ABCG1,ABCG5,ABCG8)が、生体内のコレステロール恒常性維持に重要な役割を果たすが、コレステロールを基質として輸送するのか、あるいはリン脂質輸送によって細胞膜環境を変えることで間接的にコレステロール輸送に関与するかなど、その分子機構は明らかではない。ABCタンパク質の輸送基質と輸送機構を解析することで、コレステロール恒常性機構を明らかにすることを目的として実験を行った。動物培養細胞HEK293のABCG1安定発現株を樹立し、ABCG1発現細胞から、コレステロールとコリンリン脂質が排出されること、高密度リポタンパク質(HDL)存在下で排出が増加することを見出した。質量分析と薄層クロマトグラフィー解析から、リン脂質の内、ABCA1発現細胞ではホスファチジルコリンが主に排出されるのに対し、ABCG1発現細胞ではホスファチジルコリンとスフィンゴミエリンが排出されることを明らかにした。ABCA1を昆虫培養細胞で大量発現させ、ニッケルレジンカラムを用いて精製した。精製標品のATP加水分解活性を測定し、ABCA1がATP加水分解活性を持つこと、脂質に再構成するとその活性が上昇することを明らかにした。ABCA1のWalkerAモチーフのリジン変異体では活性が低かったことから、加水分解活性がABCA1特異的なものであることを明らかにした。様々なリン脂質組成のリポソームに再構成して活性を検討した結果、ABCA1がコレステロールとホスファチジルコリンを基質として輸送し、アポリポタンパク質AIに受け渡すことが示唆された。これらのことから、抹消細胞でABCA1とABCG1が協調してコレステロールを排出し、HDL形成に関与する可能性を示した。

多种ABC蛋白（ABCA1、ABCG1、ABCG5、ABCG8）在维持体内胆固醇稳态方面发挥着重要作用，但它们并不作为底物或通过磷脂转运改变细胞膜环境来间接转运胆固醇，其分子机制包括。它是否参与胆固醇转运尚不清楚。我们通过分析 ABC 蛋白的转运底物和转运机制进行了实验，以阐明胆固醇稳态的机制。我们建立了稳定表达ABCG1的HEK293动物细胞系，发现表达ABCG1的细胞分泌胆固醇和胆碱磷脂，并且在高密度脂蛋白（HDL）存在的情况下分泌增加。质谱和薄层色谱分析表明，磷脂中，磷脂酰胆碱主要在ABCA1表达细胞中分泌，而磷脂酰胆碱和鞘磷脂在ABCG1表达细胞中分泌。 ABCA1 在培养的昆虫细胞中大量表达，并使用镍树脂柱进行纯化。我们测量了纯化样品的 ATP 水解活性，发现 ABCA1 具有 ATP 水解活性，并且当重构为脂质时其活性增加。 ABCA1 的 WalkerA 基序的赖氨酸突变体的活性较低，表明水解活性是 ABCA1 特有的。在用各种磷脂组合物重新溶解到脂质体中并检查其活性后，表明ABCA1将胆固醇和磷脂酰胆碱作为底物转运并将它们传递给载脂蛋白AI。这些发现表明 ABCA1 和 ABCG1 在外周细胞中协同分泌胆固醇，并可能参与 HDL 形成。