ヒトES及びiPS由来心筋細胞の電気的な成熟過程とその分子機構の解明

阐明人ES和iPS来源的心肌细胞的电成熟过程及其分子机制

基本信息

批准号：
22790731
负责人：
遠山周吾
金额：
$ 2.25万
依托单位：
Keio University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Young Scientists (B)
财政年份：
2010
资助国家：
日本
起止时间：
2010 至无数据
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-22790731/
关键词：
ES細胞 iPS細胞ヒトイオンチャネル成熟化心筋細胞活動電位

项目摘要

【目的】ヒトES及びiPS由来心筋細胞において培養期間・条件によってどの種類の心筋細胞が出現し、どのように成熟化していくのか電気生理学的4種の手法を駆使して詳細に解析する。さらに、その分子機構に迫り、表現型との両面から多様な心筋細胞の発生分化を理解する。【方法】培養早期(30日未満)と後期(60日以降)におけるヒトEs及びiPS由来心筋細胞の活動電位変化を解析する。ヒトES及びiPS由来心筋細胞を培養時期に応じて精製し、多様性の変化を4種の電気生理学的手法で評価する。培養時期に応じた精製心筋細胞のイオンチャネルの遺伝子・蛋白発現量変化やそれらをコントロールする上流の遺伝子候補を探索する。【結果】まずヒトES及びiPS由来心筋細胞における様々なタイプの活動電位波形(結節型・心房型・心室型)を微小電極法により解析することに成功した。さらに培養早期から後期にかけての活動電位波形パターンを解析することで結節型、すなわちペースメーカ細胞の割合が減少し、心室筋細胞が増加することを見出した。さらにヒトES及びiPS由来の胚様体からミトコンドリア高発現分画をFACSを用いて抽出する(Hattori F Nature Methods 2011)ことで培養時期に応じたヒトES及びiPS由来精製心筋細胞を抽出した。培養時期に応じた精製後ヒトES及びiPS由来心筋細胞のチャネル電流の量的機能的解析を行うため、パッチクランプ法によって経時的変化を評価したところ、やはりペースメーカー電流が培養時期に応じて減少傾向にあることを確認した。また、さらにイオンチャネルにおける遺伝子発現量の変化をQT-PCRにより評価したところ、HCNチャネルは低下傾向にあることを確認した。今後、他のイオンチャネルに関する発現量の変化を解析し、さらにそれらをコントロールする上流の遺伝子候補を探索していく。

[目的] 使用四种电生理学技术，我们将详细分析人 ES 和 iPS 来源的心肌细胞根据培养时间和条件出现哪些类型的心肌细胞以及它们如何成熟。此外，我们还将探讨分子机制，从表型和表型的角度了解各种心肌细胞的发育和分化。 [方法]我们分析了人Es和iPS来源的心肌细胞在早期（小于30天）和晚期（60天后）培养过程中的动作电位变化。人类 ES 和 iPS 来源的心肌细胞将根据培养时间进行纯化，并使用四种电生理技术评估多样性的变化。我们将探索纯化心肌细胞中离子通道的基因和蛋白质表达水平的变化，具体取决于培养时间和控制这些变化的上游候选基因。 [结果] 首先，我们使用微电极法成功分析了人 ES 和 iPS 来源的心肌细胞中的各种类型的动作电位波形（结节型、心房型和心室型）。此外，通过分析培养早期到晚期的动作电位波形模式，我们发现结节细胞（即起搏细胞）的比例减少，心室肌细胞的比例增加。此外，通过使用FACS(Hattori F NatureMethods 2011)从人ES和iPS来源的胚状体中提取线粒体高表达的级分，根据培养时间提取人ES和iPS来源的纯化心肌细胞。为了定量和功能分析纯化的人 ES 和 iPS 来源的心肌细胞的通道电流随培养时间的变化，我们使用膜片钳方法评估了随时间的变化，发现起搏器电流也随培养时间而下降。我确认确实如此。此外，当我们通过QT-PCR进一步评估离子通道中基因表达水平的变化时，我们证实HCN通道有减少的趋势。未来，我们将分析其他离子通道表达水平的变化，并寻找控制它们的上游候选基因。