原子間力顕微鏡を用いた統合ナノ計測によるPrestinの構造変化メカニズム解明

使用原子力显微镜进行集成纳米测量阐明 Prestin 的结构变化机制

• 批准号: 22791564
• 负责人: 村越 道生
• 金额: $ 2.16万
• 依托单位: Tohoku University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Young Scientists (B)
• 财政年份: 2010
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2010 至 2011
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-22791564/
• 关键词: 外有毛細胞; Prestin; 膜タンパク質; タンパク質モーター; 膜貫通構造; 原子間力顕微鏡

哺乳類の鋭敏な聴覚は,内耳に存在する外有毛細胞(outer hair cell: OHC)の伸縮運動に起因する.この運動能は,細胞側壁の膜タンパク質prestin(プレスチン)の構造変化で実現されると予測されている.しかし膜タンパク質の立体構造とその構造変化を計測する方法は確立されておらず,そのためprestinの構造変化メカニズムは解明されていない.そこで本研究では,原子間力顕微鏡(atomic force microscope: AFM)を用いてプレスチンの一分子構造および構造変化を直接計測できる技術を確立し,分子レベルでその構造変化メカニズムを解明することを目指す.本年度は,膜タンパク質の構造変化を捉えることができる新たな原子間力顕微鏡(AFM)システム(パッチクランプAFM)を開発し,プレスチンの構造変化メカニズムを解明することを目的とし,AFM用膜電位制御デバイスの作製に取り組んだ.細胞膜電位の制御にパッチピペットを用いず,細胞を播種する基板に直接パッチ用の穴を設ける.パッチクランプ時に電気的漏れがない状態(ギガシール状態)を高効率で達成するため,当初計画では基板にborosilicate(ボロシリケイト)製のものを使用することを検討していたが,ボロシリケイトガラスは硬くて脆い材料であり,穴あけ加工が困難であった.そこで,計画を変更し,耐薬品性,耐電気特性が高い樹脂であるテフロン樹脂を用いて基板作製を試みた.その結果,直径～5μmの穴の開いた基板の作製に成功した.今後,作製したテフロン基板の膜厚や穴径の最適化を行い,基板上に細胞膜を単離し,その電気特性の計測を行う計画である.

哺乳动物中敏感的听力感是由于内耳内部外毛细胞（OHC）的伸展运动引起的。预计通过细胞侧壁上的膜蛋白prestin（prestin）的结构变化来预测这种运动能力。但是，尚无确定测量膜蛋白的三维结构及其结构变化的方法，因此尚未阐明普雷斯汀结构变化的机制。在这项研究中，在这项研究中，我们表明了原子力显微镜：我们建立了一种可以直接使用AFM测量Prestin的结构和结构变化的技术，并旨在阐明分子水平上结构变化的机制。今年，我们开发了一种新的原子力显微镜（AFM）系统（贴片夹AFM），该系统可以捕获膜蛋白的结构变化，并且我们一直在为AFM的膜电位控制装置制造，目的是阐明Prestin的机制。在不使用斑块移液管控制细胞膜电位的情况下，我们直接在底物上创建了一个斑块的孔。贴片夹具期间发生电泄漏。为了在没有特氟隆基板（GIGASEAL状态）的情况下达到高效率，原始计划是考虑使用硼硅酸盐底物，但是硼硅酸盐玻璃是一种坚硬而脆弱的材料，使得难以钻孔。因此，更改了计划，并尝试使用具有高耐化学性和电阻的树脂来制造底物。结果，我们成功地制造了一个高达5μm的孔的底物。将来，我们将优化我们制造的Teflon底物的薄膜厚度和孔直径，并在基板上分离细胞膜并测量其电性能。

项目成果

Analysis of membrane topology of prestin expressing in CHO cells

CHO 细胞中表达的 prestin 的膜拓扑分析

• 发表时间: 2011
• 作者: Murakoshi M;Kawase T;Kumano S;Wada H
• 通讯作者: Wada H

Salicylate-induced translocation of prestin having mutation in the GTSRH sequence to the plasma membrane

水杨酸盐诱导 GTSRH 序列突变的 prestin 易位至质膜

• 发表时间: 2010
• 期刊: FEBS Lett.
• 作者: Shun Kumano;et al.
• 通讯作者: et al.

Prestin, the inner ear motor protein-its structure and function

Prestin，内耳运动蛋白-其结构和功能

• 发表时间: 2012
• 作者: Wada H;Kumano S;Murakoshi M;Koyama S
• 通讯作者: Koyama S

内耳モータータンパク質プレスチンの膜貫通構造解析-原子間力顕微鏡を用いて-(Analysis of transmembrane structure of the inner ear motor protein prestin-atomic force microscopy study-)

内耳运动蛋白prestin跨膜结构分析-原子力显微镜研究-

• 发表时间: 2011
• 作者: Iida K;Murakoshi M;Kumano S;Tsumoto K;Ikeda K;Kobayashi T;Kumagai I;Wada H;村越道生
• 通讯作者: 村越道生

内耳増幅機構における外有毛細胞の協調運動の重要性(Importance of outer hair cell coordinating movement for cochlear amplification)

外毛细胞协调运动对耳蜗放大的重要性

• 发表时间: 2011
• 作者: 鈴木翔;他
• 通讯作者: 他