ナノバイオアクチュエータに最適なタンパク質モータプレスチンの構造・機能解析

蛋白质运动 prestin 的结构和功能分析，它是纳米生物执行器的理想选择

• 批准号: 07J02194
• 负责人: 村越 道生
• 金额: $ 0.64万
• 依托单位: Tohoku University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for JSPS Fellows
• 财政年份: 2007
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2007 至 2008
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-07J02194/
• 关键词: 外有毛細胞; タンパク質モータ; プレスチン; 免疫原子間力顕微鏡法; 量子ドット

哺乳類の鋭敏な聴覚は,内耳に存在する外有毛細胞(OHC)の伸縮運動に起因する.この運動能は細胞側壁に存在する膜タンパク質プレスチンの構造変化で実現されると予測されている.プレスチンは,ATP非依存,〜100kHzに及ぶ周波数応答性を持つなど高機能モータタンパク質としてこれまでにないユニークな特徴を有しており,理想的なバイオアクチュエータの材料として工学分野への応用が期待できる.この実現のためには,プレスチンの詳細な立体構造の解析と構造変化メカニズムの解明が必要不可欠である.そこで本研究では,立体構造の解析に向け,プレスチン発現チャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞を用い,原子間力顕微鏡(AFM)と半導体量子ドット(Qdot)を組み合わせた免疫原子間力顕微鏡法について検討し,その手法を用いてプレスチンの微細構造の可視化を試みた.まず超音波破砕法によりプレスチン発現CHO細胞の細胞膜を基板上に単離し,抗プレスチン一次抗体およびQdot標識二次抗体でプレスチンをラベリングした.次にQdotが発する蛍光でプレスチンの存在を確認後,AFMでその部位を観察した.Qdotは直径約8nmの硬い半導体材料であるためAFMで容易に観察可能である.プレスチン分子はQdot近傍に存在するため,これによりその位置が特定できる.確認したプレスチン一分子をより高解像度で観察し詳細な構造の解析を行った.その結果,Qdotの直近に4つのPeakと中央に一つのくぼみを持つRing-likeな構造が観察された.これは,プレスチンがCHO細胞の細胞膜中で,4量体で存在していることを示唆している.さらに,観察されたRing-like構造物の直径の分布を調べた結果,9.6nmおよび13nmに2つのピークが観察された.この結果は,プレスチンが小さな状態と大きな状態の2状態をとることを示唆している.

哺乳动物的敏锐听力是由于内耳外毛细胞 (OHC) 的拉伸和收缩运动所致，预计这种运动能力是通过存在于细胞侧壁中的膜蛋白 prestin 的结构变化来实现的。 Prestin 不依赖于 ATP。 ，它具有作为高性能运动蛋白从未见过的独特特性，例如〜100kHz的频率响应，有望作为理想的生物致动器材料应用于工程领域。为了实现这一点，为此，有必要分析prestin的详细三维结构并阐明其结构变化机制，因此，在本研究中，我们使用表达prestin的中国仓鼠卵巢（CHO）细胞来分析其三维结构。我们研究了结合显微镜 (AFM) 和半导体量子点 (Qdots) 的免疫原子力显微镜，并尝试使用这种方法可视化 prestin 的精细结构。首先，我们使用超声破碎来可视化表达 prestin 的 CHO 细胞。将膜分离在基板上，用抗prestin一抗和Qdot标记二抗标记prestin，然后通过Qdots发射的荧光确认prestin的存在，并使用AFM观察该位点。 Qdots 的直径约为 8n。由于它是m的硬半导体材料，因此可以很容易地用AFM进行观察。由于prestin分子存在于Qdot附近，因此可以识别其位置。可以以更高分辨率观察已确认的prestin分子，以确定详细的结构分析。的结果，在Qdot附近观察到具有四个峰和一个凹陷的环状结构，这是因为prestin作为四聚体存在于CHO细胞的细胞膜中。另外，对所观察到的环状结构的直径分布进行调查，结果在9.6nm和13nm处观察到两个峰，该结果表明prestin具有小状态和大状态的两种状态。

项目成果

Biomechanics at Micro-and Nanoscale levels Vol. IV, H. Wada (Ed.),

微米和纳米级生物力学卷。

• 发表时间: 2007
• 作者: Hiroshi Murase;Atsuo Terada;Takefumi Ueda;Tadahito Yamamoto;植田 剛史;Hideya Takahashi;Hideya Takahashi;兵藤晋;加藤花野子;坂本竜哉;久戸瀬広紀;Hideya Takahashi;Chiyo Takagi;Tatsuya Sakamoto;坂本竜哉;Hideya Takahashi;高木智世;美並彰吾;Yoko Kitsunai;Michio Murakoshi;Shun Kumano;Koji Iida;村越道生;村越道生;Michio Murakoshi;Michio Murakoshi;村越道生;Michio Murakoshi;Michio Murakoshi;Hiroshi Wada
• 通讯作者: Hiroshi Wada

Future Medical Engineering Based on Bionanotecnology, M. Esashi, K. Ishii, N. Ohuchi, N. Ohsumi, M. Sato, T. Yamaguchi(Eds.)

基于生物技术的未来医学工程，M. Esashi，K. Ishii，N. Ohuchi，N. Ohsumi，M. Sato，T. Yamaguchi（编辑）

• 发表时间: 2007
• 作者: Hiroshi Murase;Atsuo Terada;Takefumi Ueda;Tadahito Yamamoto;植田 剛史;Hideya Takahashi;Hideya Takahashi;兵藤晋;加藤花野子;坂本竜哉;久戸瀬広紀;Hideya Takahashi;Chiyo Takagi;Tatsuya Sakamoto;坂本竜哉;Hideya Takahashi;高木智世;美並彰吾;Yoko Kitsunai;Michio Murakoshi;Shun Kumano;Koji Iida;村越道生;村越道生;Michio Murakoshi;Michio Murakoshi;村越道生;Michio Murakoshi;Michio Murakoshi;Hiroshi Wada;Michio Murakoshi
• 通讯作者: Michio Murakoshi

量子ドットで標識したタンパク質モータプレスチンの原子間力顕微鏡による可視化(Imaging by atomic force microscopy of the motor protein prestin labeled with quantum dots)

通过原子力显微镜对量子点标记的运动蛋白 prestin 进行成像

• 发表时间: 2008
• 作者: Hiroshi Murase;Atsuo Terada;Takefumi Ueda;Tadahito Yamamoto;植田 剛史;Hideya Takahashi;Hideya Takahashi;兵藤晋;加藤花野子;坂本竜哉;久戸瀬広紀;Hideya Takahashi;Chiyo Takagi;Tatsuya Sakamoto;坂本竜哉;Hideya Takahashi;高木智世;美並彰吾;Yoko Kitsunai;Michio Murakoshi;Shun Kumano;Koji Iida;村越道生;村越道生
• 通讯作者: 村越道生

Molecular Protocols in Auditory Research, J. Walker (Ed.)

听觉研究中的分子协议，J. Walker（主编）

• 发表时间: 2008
• 作者: Hiroshi Murase;Atsuo Terada;Takefumi Ueda;Tadahito Yamamoto;植田 剛史;Hideya Takahashi;Hideya Takahashi;兵藤晋;加藤花野子;坂本竜哉;久戸瀬広紀;Hideya Takahashi;Chiyo Takagi;Tatsuya Sakamoto;坂本竜哉;Hideya Takahashi;高木智世;美並彰吾;Yoko Kitsunai;Michio Murakoshi;Shun Kumano;Koji Iida;村越道生;村越道生;Michio Murakoshi;Michio Murakoshi;村越道生;Michio Murakoshi;Michio Murakoshi
• 通讯作者: Michio Murakoshi

Effects of heat stress on filamentous actin and prestin of outer hair cells in mice

• DOI: 10.1016/j.brainres.2007.08.019
• 发表时间: 2007-10-26
• 期刊: BRAIN RESEARCH
• 影响因子: 2.9
• 作者: Kitsunai, Yoko;Yoshida, Naohiro;Wada, Hiroshi
• 通讯作者: Wada, Hiroshi