光周的花芽誘導に関連した遺伝子のウキクサホモログの単離と発現解析

浮萍光周期花芽诱导相关基因同源物的分离及表达分析

• 批准号: 03J00948
• 负责人: 三輪 久美子
• 金额: $ 1.73万
• 依托单位: Nagoya University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for JSPS Fellows
• 财政年份: 2003
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2003 至 2005
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-03J00948/
• 关键词: 光周的花芽誘導; 概日時計; ウキクサ; パーティクルガン; 発光レポーター系; 過剰発現; RNAi; 発光測定; 遺伝子単離; 形質転換; 発現解析

本研究では2種のウキクサを用いて、光周的花芽誘導の分子生物学的な解析を行っている。光周的花芽誘導の日長測定には概日時計が非常に重要なので、本年度は主に発光レポーター系を利用した概日リズムの解析を以下のように行った。1.シロイヌナズナのCCA1やAPRR1、ウキクサのLgLHYH1のプロモーターにルシフェラーゼ遺伝子をつないだ発光レポーターコンストラクトとウキクサのLHY、GI、ELF3ホモログ遺伝子に35Sをつないで過剰発現させたコンストラクトおよびRNAiによって発現量を低下させたコンストラクトを2つのウキクサで全ての組み合わせで同時に導入し、発光測定を行った。その結果過剰発現では全て発光が下がり、概日リズムは見られなくなった。RNAiではLHYホモログは短周期になり、GIホモログ、ELF3ホモログはリズムがなくなった。このことからウキクサのホモログ遺伝子が概日リズムに機能を持つことが明らかとなった。2.インバースPCRによってウキクサからCABのプロモーターを単離した。プロモーターには光応答に関わるTATA-boxやCAAT-box、概日リズム発現に関わるevening-elementが保存されていた。このプロモーターをLUCにつないだコンストラクトを作成し、発光測定を行ったところCABの発現と同様に夕方にピークを示す概日リズムを示した。3.発光レポーター系で発光量とLUCの発現量に相関があるかを確認するために発光レポーターを導入したウキクサのサンプリングを行い、リアルタイムPCRによる発現解析を行った。その結果相関が見られたので発光リズムはプロモーターへの制御を反映していることが示された。また本年度は論文を作成し、発表した。

在这项研究中，我们正在使用两种浮萍对光周期花芽诱导进行分子生物学分析。由于生物钟对于光周期花芽诱导光周期测量非常重要，因此今年我们主要使用发光报告系统分析昼夜节律如下。 1.使用发光报告构建体降低表达水平，其中荧光素酶基因连接至拟南芥CCA1和APRR1和浮萍LgLHYH1的启动子，其中35S连接至浮萍LHY、GI和ELF3同源基因，并且RNAi 将构建的构建体同时引入所有组合的两种浮萍中，并进行发光测量。结果，在所有过度表达的情况下，发光减少并且不再观察到昼夜节律。在RNAi中，LHY同源物变得短周期，GI同源物和ELF3同源物变得无节律。这表明浮萍同源基因在昼夜节律中具有功能。 2.通过反向PCR从浮萍中分离出CAB启动子。参与光反应的TATA盒和CAAT盒以及参与昼夜节律表达的晚间元件在启动子中是保守的。创建了一个构建体，其中该启动子与 LUC 连接，并进行了发光测量，结果显示昼夜节律在晚上达到峰值，类似于 CAB 的表达。 3.为了确认发光报告系统的发光量与LUC表达水平之间是否存在相关性，我们对引入发光报告系统的浮萍进行了取样，并使用实时PCR分析了其表达量。结果发现了相关性，表明发光节律反映了启动子的控制。今年，我还撰写并发表了一篇论文。