昆虫由来の受容体遺伝子を用いた人工受容体の開発と神経回路網研究への応用

利用昆虫受体基因开发人工受体及其在神经网络研究中的应用

基本信息

批准号：
14780582
负责人：
森田光洋
金额：
$ 1.73万
依托单位：
Tokyo University of Pharmacy and Life Science
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Young Scientists (B)
财政年份：
2002
资助国家：
日本
起止时间：
2002 至 2003
项目状态：
已结题

项目摘要

オクトパミンは無脊椎動物にみられる神経伝達物質であり、脊椎動物では合成されず受容体も存在しない。ショウジョウバエのオクトパミン受容体はGタンパク質共役型であり、細胞内カルシウム上昇とcAMP産生を引き起こすことが知られている。オクトパミン受容体遺伝子を脊椎動物由来の細胞に導入した場合、遺伝子発現した細胞選択的に細胞応答が引き起こされると予想される。この点に注目し、複雑な神経回路網において特定の細胞が示すカルシウム上昇などがシステム全体に果たす役割を解明する手段の開発を試みた。具体的にはオクトパミン受容体が脊椎動物細胞において引き起こす細胞応答の解析と、細胞種特異的プロモーターを用いた標的細胞におけるオクトパミン受容体の発現と、これにより引き起こされる神経活動の解析を行った。哺乳動物由来であるPC12h細胞、初代培養神経細胞およびアストロサイトにオクトパミン受容体を発現させた場合、PC12h細胞とアストロサイトにおいてオクトパミン刺激に対するカルシウム応答が見られたが、神経細胞は反応を示さなかった。しかし、電気生理学的解析を行ったところ、神経細胞においては脱分極刺激に対するカルシウム上昇の増強と、カリウムチャンネルの抑制が見られることが明らかになった(現在投稿中)。オクトパミン受容体を細胞種特異的に発現させる目的で、神経細胞とアストロサイトにそれぞれ特異的なプロモーターを培養細胞系において確立した(Tsuchiya et al., Brain Res. 2002)。これを用いてオクトパミン受容体を培養神経細胞および海馬由来スライス培養標本において細胞種特異的に発現させ、これを刺激した際の神経活動を検討中である。神経活動を効率的に検討する方法として、スライス培養標本における共焦点レーザー顕微鏡を用いたカルシウムイメージングを確立した(Morita et al., J.Neurosci. 2003)。

章鱼胺是无脊椎动物中发现的一种神经递质；它在脊椎动物中不被合成并且没有受体。果蝇章鱼胺受体是 G 蛋白偶联的，已知会导致细胞内钙升高和 cAMP 产生。当将章鱼胺受体基因导入脊椎动物来源的细胞时，预计将在表达该基因的细胞中选择性地诱导细胞反应。针对这一点，我们试图开发一种方法来阐明特定细胞中钙水平升高在复杂神经网络的整个系统中所起的作用。具体来说，我们分析了脊椎动物细胞中章鱼胺受体诱导的细胞反应，使用细胞类型特异性启动子在靶细胞中表达章鱼胺受体，并分析了由此引起的神经活动。当章鱼胺受体在哺乳动物来源的 PC12h 细胞、原代培养的神经元和星形胶质细胞中表达时，在 PC12h 细胞和星形胶质细胞中观察到对章鱼胺刺激的钙反应，但神经元没有表现出反应。然而，电生理学分析表明，神经元响应去极化刺激而表现出钙离子升高和钾通道抑制增强（目前正在提交）。为了以细胞类型特异性的方式表达章鱼胺受体，我们在培养的细胞系中建立了神经元和星形胶质细胞特异性的启动子（Tsuchiya et al., Brain Res. 2002）。我们正在利用它在培养的神经元和海马切片培养标本中以细胞类型特异性的方式表达章鱼胺受体，并正在研究刺激时的神经活动。我们使用共聚焦激光显微镜在切片培养标本中建立了钙成像，作为有效检查神经活动的方法（Morita 等人，J.Neurosci. 2003）。