糖尿病網膜症における高血糖と網膜神経細胞死の因果関係の解析

糖尿病视网膜病变高血糖与视网膜神经细胞死亡的因果关系分析

基本信息

批准号：
14770956
负责人：
中村誠
金额：
$ 2.43万
依托单位：
Kobe University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Young Scientists (B)
财政年份：
2002
资助国家：
日本
起止时间：
2002 至 2004
项目状态：
已结题

项目摘要

上強膜静脈焼灼により、ラット片眼慢性高眼圧モデルを作製した。対眼には結膜切開のみのsham-operationを行った。眼圧をウレタン麻酔下で測定後、網膜を摘出し、クライオ切片ないし伸展標本作成後、リン酸化Aktによる免疫染色、terminal dUTP nick end labeling (TUNEL)染色、全およびリン酸化Akt抗体、リン酸化インスリン/IGF-1受容体抗体、およびインスリンβ受容体抗体を用いてWestern blottingを行った。組織摘出時期は、上強膜静脈焼灼後3日、2週、1ヶ月、3ヶ月の時点である。結果、眼圧は、3日後にピークとなった後、経時的に減少していたが、3ヶ月まで対眼に比べ有意に上昇していた。眼圧上昇に対応して、TUNEL染色陽性細胞数は上昇し、眼圧依存性のアポトーシスによるRGCの減少が見られた。クライオ切片ならびに伸展標本による免疫染色では、RGCが特異的にリン酸化Aktを発現しており、リン酸化Akt陽性RGCは3日後がピークで、一ヶ月後までみられた。Western blottingにより、リン酸化Aktの発現上昇に呼応して、インスリン/IGF-1受容体のリン酸化が上昇していた。慢性高眼圧ストレスによりRGCがアポトーシスを生じるが、それを代償するインスリン/IGF-1からAkt経路が、RGCにおいて賦活化されている可能性が示唆された。また、ストレプトゾトシン誘発糖尿病ラットに同様の高眼圧ストレスを負荷した場合、各々単独のストレス負荷よりRGCアポトーシス数が増加することから、糖尿病は緑内障性視神経障害の危険因子である総説を作製した。さらに、ウノプロストンがこれら網膜神経細胞のアポトーシスを抑制するかどうかを検討するため、活性化代謝物M1とM2を網膜前駆細胞R28細胞に投与し、血清除去により誘導されるアポトーシスに対する保護効果を検討した。その結果、M1のみがPI3K, PKG経路を活性化することで、アポトーシスを抑制することが判明した。

采用巩膜外静脉消融术建立大鼠单侧慢性高眼压模型。对另一只眼睛进行仅切开结膜的假手术。在乌拉坦麻醉下测量眼压后，取出视网膜并制备冷冻切片或延伸标本，然后用磷酸化 Akt 进行免疫染色、末端 dUTP 缺口末端标记 (TUNEL) 染色、总和磷酸化 Akt 抗体，并进行磷酸化胰岛素蛋白质印迹分析。使用IGF-1受体抗体和胰岛素β受体抗体进行。巩膜外静脉消融后3天、2周、1个月和3个月进行组织提取。结果，眼压在3天后达到峰值，然后随着时间的推移而下降，但与对照眼相比，直到3个月，眼压仍显着升高。随着眼压升高，TUNEL 阳性细胞数量增加，并且观察到由于眼压依赖性细胞凋亡导致 RGC 减少。使用冷冻切片和涂抹标本的免疫染色显示，RGC 特异性表达磷酸化 Akt，磷酸化 Akt 阳性 RGC 在 3 天后达到峰值，并持续到 1 个月后。 Western blotting 显示胰岛素/IGF-1 受体磷酸化随着磷酸化 Akt 表达的增加而增加。提示胰岛素/IGF-1至Akt通路可能在RGC中被激活，该通路补偿慢性高眼压应激引起的RGC凋亡。此外，当链脲佐菌素诱导的糖尿病大鼠受到类似的高眼压应激时，RGC凋亡数量比单独施加每种应激时增加更多。因此，我们撰写了一篇综述文章，表明糖尿病是青光眼性视神经病变的危险因素。此外，为了检查乌诺前列酮是否抑制这些视网膜神经元的细胞凋亡，我们将活化的代谢物 M1 和 M2 给予视网膜祖细胞 R28，并检查它们对血清撤药诱导的细胞凋亡的保护作用。结果显示，只有 M1 通过激活 PI3K 和 PKG 途径来抑制细胞凋亡。