体細胞核移植クローン技術を用いたヒトてんかん責任遺伝子改変モデルラットの作成

利用体细胞核移植克隆技术创建导致人类癫痫的转基因大鼠模型

基本信息

批准号：
10J09798
负责人：
石井敦士
金额：
$ 0.45万
依托单位：
Fukuoka University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for JSPS Fellows
财政年份：
2010
资助国家：
日本
起止时间：
2010 至无数据
项目状态：
已结题

项目摘要

先にDravet症候群患者で直接シークエンス法で同定したGABA_A受容体γ2サブユニットをコードするGABRG2遺伝子におけるナンセンス変異であるp.R40X変異を海馬由来初代培養神経細胞に導入し、細胞内局在を抗γ2サブユニット抗体用いて蛍光免疫染色で観察した。γ2サブユニットは野生株では細胞体、樹状突起、軸索末端迄出現していたが、変異導入細胞では軸索末端への分布は減少していた。同時にα1、β2の各サブユニットの分布を観察したが、両者共に軸索への分布は減少していた。また、小胞体マーカーとしてカルネキシン、ゴルジ装置マーカーとしてGM130とp115を用い二重染色し、変異導入細胞ではカルネキシンとα1、β2サブユニットが同じ局在であり小胞体内にα1、β2が蓄積していた。これは、先にHEK293細胞で観察した結果と同様であり、神経細胞でもGABRG2変異(R40X)はGABA_A受容体を小胞体内に蓄積し、軸索末端への細胞内輸送を阻害するドミナント・ネガティブ効果を示した。また、同じGABRG2遺伝子で直接シークエンス法でp.N40Sのミスセンス変異を全身性強直間代性けいれん患者で同定した。GABRG2遺伝子の変異は他に素因性てんかん熱性けいれんプラス(genetic epilepsy with febrile seizures plus: GEFS+)で同定されており遺伝子型と表現形の関連性が以前不明瞭であったが、今年度の結果より細胞内輸送の異常が表現形に影響することが神経細胞でも証明され、モデル動物でもヒトと同じ表現形をとると期待できる結果を得た。同時に、新たにCa^<2+>チャネルをコードするCACNA1AとCACNA1B遺伝子を難治性特発性てんかんに対して直接シークエンス法にて変異を探索しており遺伝子異常が見出された際は、イオンチャネルを標的としたヒトてんかんモデルラット作製が可能となる。

我们将 p.R40X 突变（编码 GABA_A 受体 γ2 亚基的 GABRG2 基因中的无义突变）引入到海马来源的原代培养神经元中，并通过抗-γ2通过使用亚单位抗体的荧光免疫染色进行观察。在野生型细胞中，γ2亚基出现在细胞体、树突和轴突末端，但在突变细胞中，其在轴突末端的分布减少。同时，我们观察了α1和β2亚基的分布，发现这两个亚基到轴突的分布都减少了。另外，使用钙连接蛋白作为内质网标记物以及GM130和p115作为高尔基体标记物进行双重染色，在引入突变的细胞中，钙连接蛋白以及α1和β2亚基同时定位，并且α1和β2在细胞内累积。内质网。这与之前在 HEK293 细胞中观察到的结果类似，在神经元细胞中，GABRG2 突变（R40X）在内质网中积累 GABA_A 受体，并且是抑制细胞内向轴突末端转运的显性失活受体，被证明是有效的。。我们还通过直接测序在一名全身性强直阵挛性惊厥患者的同一 GABRG2 基因中发现了 p.N40S 错义突变。在遗传性癫痫伴热性惊厥+（GEFS+）中也发现了GABRG2基因的突变，之前尚不清楚基因型和表型之间的关系，但根据今年的结果，已经在神经细胞中证实了细胞内运输的异常。影响表型，我们获得了有希望的结果，模型动物表现出与人类相同的表型。同时，我们正在利用直接测序方法寻找新编码难治性特发性癫痫的Ca^2+通道的CACNA1A和CACNA1B基因的突变，从而使创建靶向人类癫痫模型成为可能。