酵母ユビキチンリガーゼRsp5による異常タンパク質の分解とその制御機構の解明

酵母泛素连接酶Rsp5降解异常蛋白及其调控机制的阐明

• 批准号: 10J09119
• 负责人: 佐々木 俊弥
• 金额: $ 0.9万
• 依托单位: Nara Institute of Science and Technology
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for JSPS Fellows
• 财政年份: 2010
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2010 至 2011
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-10J09119/
• 关键词: ユビキチン; Rsp5; パーミアーゼ; 異常タンパク質; タンパク質分解; エンドサイトーシス; ストレス

出芽酵母において高濃度エタノール添加後にGap1がエンドサイトーシスを起こす現象をこれまでに見出した。エタノールをストレスとしてセンサーで感知しているのか、Gap1のアンフォールディングそのものを認識しているのか、この現象の引き金を明らかにすべく、Gap1温度感受性変異体の取得を目指した。もし、変性を認識するのであれば、高温時にアンフォールディングしたGap1をRsp5がユビキチン化し、エンドサイトーシスを起こすと考えられた。このスクリrニングでは、高温でGap1が変性した場合のみ生育するように、プロリン毒性アナログ培地によるポジティブセレクションを行ったが、残念ながら、本年度での取得には至らなかった。一方、Rsp5のリン酸化については、これまで用いていた抗リン酸化Rsp5血清によるリン酸化Rsp5の検出感度を上げるため、抗体のアフィニティー精製を行った。その結果、リン酸化Rsp5の検出感度が大幅に増加したが、資化しにくい窒素源を用いて培養した場合、リン酸化されないはずのRsp5ミュータント(T357A-Rsp5)でもバンドが検出された。このことから、おそらく予想していたThr357以外にも、Rsp5内に保存された同様のドメイン内のThrがリン酸化されているのではないかと考えられた。Gap1認識を仲介するアダプターであるBul1/2とT357A-Rsp5の結合を共免疫沈降法で検出した。T357Aのミュータントではアダプターとの結合能が上がると予想しており、Bul2に関してはその傾向が見られた。しかし、強制発現プロモーターを用いているにも関わらず、BUl1/2の発現量が一定にはならず、特に357A-Rsp5発現株においては、野生株よりも発現量が低かった。これらのことから、当初考えていた単純では描ききれないファクターが残されていると考えられる。Rsp5のリン酸化に関わるキナーゼ・フォスファターゼを当初の予定通りスクリーニングした。その中からフォスファターゼの候補としてSit4が見出された。

我们以前已经发现了一种现象，其中GAP1在添加高浓度的乙醇中在发芽的酵母中引起内吞作用。为了阐明这种现象的触发因素，我们旨在获得GAP1温度敏感的突变体。如果确认变性，则认为GAP1的RSP5泛素化在高温下展开，导致内吞作用。在此筛选中，使用脯氨酸有毒模拟培养基进行阳性选择，以便GAP1仅在高温下变性时生长，但不幸的是，今年的结果未能实现。另一方面，关于RSP5的磷酸化，抗体是亲和力纯化的，以提高抗磷酸化的RSP5血清对磷酸化RSP5的检测敏感性，直到现在到目前为止使用。结果，磷酸化的RSP5的检测灵敏度显着增加，但是当使用难以使用的氮源培养时，在RSP5突变体（T357A-RSP5）中也检测到该条带，不应磷酸化。这表明，除了预期的THR357外，在RSP5中保守的类似域中的THR还磷酸化。通过共免疫沉淀检测到Bul1/2的结合，介导GAP1识别的适配器和T357A-RSP5。我们预计T357A突变体将提高适配器的结合能力，并且在BUL2中观察到了这种趋势。然而，尽管使用强制表达启动子，但Bul1/2的表达水平仍未保持恒定，并且在357A-RSP5表达菌株中的表达水平较低，尤其是在野生菌株中。从这些原因来看，人们认为仍然剩下的因素是不可能像原来认为的那样。按照最初计划筛选参与RSP5磷酸化的激酶磷酸酶。其中，发现SIT4是磷酸酶的候选者。

项目成果

出芽酵母の恒常的活性型ユビキチンリガーゼRsp5の機能解析

酿酒酵母中组成型活性泛素连接酶 Rsp5 的功能分析

• 发表时间: 2010
• 作者: Kuwahara T;et al;佐々木俊弥;佐々木俊弥
• 通讯作者: 佐々木俊弥

酵母の恒常的活性型ユビキチンリガーゼRsp5によるプロリンパーミアーゼの活性制御

组成型活性酵母泛素连接酶 Rsp5 对脯氨酸通透酶活性的调节

• 发表时间: 2010
• 作者: Kuwahara T;et al;佐々木俊弥
• 通讯作者: 佐々木俊弥

The yeast ubiquitin ligase Rsp5 activity is regulated through phosphory lation of a highly conserved Thr357 in the Nedd4 family

酵母泛素连接酶 Rsp5 活性通过 Nedd4 家族中高度保守的 Thr357 的磷酸化来调节

• 发表时间: 2011
• 作者: N.Fukazawa;T.Ishikawa;Y.Okimoto;S.Koshihara;K.Onda;H.M.Yamamoto;R.Kato;佐々木俊弥
• 通讯作者: 佐々木俊弥

Functional analysis of the constitutively active variant of the ubiquitin ligase Rsp5 on the regulation of proline permease activity in Saccharomyces cerevisiae.

泛素连接酶 Rsp5 组成型活性变体对酿酒酵母脯氨酸通透酶活性调节的功能分析。

• 发表时间: 2010
• 作者: 石舟智恵子;他;Toshiya Sasaki
• 通讯作者: Toshiya Sasaki

酵母の恒常活性型ユビキチンリガーゼRsp5の機能解析

酵母组成型活性泛素连接酶 Rsp5 的功能分析

• 发表时间: 2011
• 作者: Ishifune C;et al;佐々木俊弥
• 通讯作者: 佐々木俊弥