新規プレニル基転移酵素の機能解析と有用化合物創製への応用

新型异戊二烯基转移酶的功能分析及其在有用化合物的制备中的应用

基本信息

批准号：
10J03411
负责人：
尾崎太郎
金额：
$ 1.34万
依托单位：
The University of Tokyo
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for JSPS Fellows
财政年份：
2010
资助国家：
日本
起止时间：
2010 至 2012
项目状态：
已结题

项目摘要

本年度は前年度同定したシクロラバンデュリルジリン酸合成酵素(CLDS)の組換えタンパク質をDMAPPと反応し、その反応産物の構造解析を行った。フォスファターゼによって反応産物からジリン酸を除去した化合物の構造をN厭によって解析したところ、シクロラバンデュロールであることが確かめられた。そのことより、CLDSがDMAPPの縮合と環化によってシクロラバンデュリルジリン酸を合成する新規のプレニルジリン酸合成酵素であることが明らかになった。このCLDSによって合成したシクロラバンデュリルジリン酸を、前年度までに同定したプレニル基転移酵素とフラビン依存型酸化酵素の反応系に供給して、フェナジン-1-カルボン酸のプレニル化反応を行った。この反応によるラバンドシアニンの生成が確認できたことから、シクロラバンデュリルジリン酸がプレニル基供与体として働くことも明らかにすることができた。また、ラバンドシアニンの生産菌においてclds遺伝子を欠失させたところ、ラバンドシアニンの生産が失われたため、CLDSがラバンドシアニンの生合成において確かにシクロラバンデュリ'ル基の形成に関与することが確かめられた。さらに、本来ラバンドシアニンを生産しない放線菌Streptomyces lividans TK23を用いたラバンドジアニン異種生産系を構築し、本研究で同定した遺伝子がラバンドシアニンの生合成に必要十分であることを確かめた。CLDSの詳細な反応機構を明らかにするために結晶構造解析も試みた。最終的な構造の決定には至らなかったが、Nativeタンパク質、およびセレノメチオニン置換体タンパク質の結晶を作製し、高い分解能の回折データを取得することができた。今後、構造を明らかにすることで新規のテルペノイド生合成機構が明らかになると期待される。以上のラバンドシアニンの生合成研究に加えて、放線菌の生産するプレニル化インドールの生合成についても研究を行った。

今年，我们将去年鉴定出的环拉班杜酰二磷酸合酶（CLDS）重组蛋白与DMAPP反应，并对反应产物的结构进行了分析。当通过N Kei分析通过使用磷酸酶从反应产物中除去二磷酸而获得的化合物的结构时，证实其是环薰衣草醇。这些结果表明，CLDS是一种新型异戊二烯基二磷酸合酶，可通过DMAPP缩合和环化合成环拉班杜基二磷酸。将由该CLDS合成的环拉班杜基二磷酸供给到去年已鉴定的异戊烯基转移酶和黄素依赖性氧化酶的反应体系中，进行吩嗪-1-羧酸的异戊二烯化反应。由于通过该反应确认了薰衣草花青的生成，因此还揭示了环薰衣草基二磷酸起到异戊二烯基供体的作用。此外，当在产生拉班花青素的细菌中删除clds基因时，拉班花青素的产生消失，表明CLDS确实参与了拉班花青素生物合成中环拉班杜基基团的形成，这得到了证实。此外，我们利用放线菌Streptomyces lividans TK23构建了异源薰衣草苷生产系统，该放线菌天然不产生薰衣草青素，并证实本研究中鉴定的基因对于薰衣草青素的生物合成是必要和充分的。我们还尝试了晶体结构分析来阐明 CLDS 的详细反应机理。尽管最终结构无法确定，但我们能够创建天然蛋白质和硒代蛋氨酸取代蛋白质的晶体，并获得高分辨率衍射数据。未来，阐明结构有望揭示新的萜类生物合成机制。除了上述薰衣草花青素的生物合成研究外，我们还研究了放线菌产生的异戊烯化吲哚的生物合成。