高等植物におけるペプチド性細胞増殖因子受容体の解析

高等植物肽细胞生长因子受体的分析

基本信息

批准号：
13760087
负责人：
松林嘉克
金额：
$ 1.6万
依托单位：
Nagoya University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Young Scientists (B)
财政年份：
2001
资助国家：
日本
起止时间：
2001 至 2002
项目状态：
已结题

项目摘要

多細胞生物においては,個体の恒常性を維持するために個々の細胞間のコミュニケーションが重要な役割を担っている.申請者らが1996年に発見したPSKは,オートクリン型の細胞間情報伝達因子として,植物細胞の分化全能性の制御に関与していることが推定されている.本研究では,PSKの個体レベルでの役割を解明することを最終目的として,PSK受容体のクローニングを目指した.PSK受容体を多量に発現していることが明らかとなっているニンジン培養細胞株を用いて,受容体の可溶化条件を検討した結果,一般的な界面活性剤であるTX-100により効率よく可溶化されることが明らかとなった.次に,効率よく受容体分子を精製するためにアフィニティーカラムの調製を試みた結果,[Lys^5]PSKの側鎖アミノ基にスペーサーを介してセファロースに固定化したカラムが,受容体に対する高い親和性を示すことが明らかとなった.このカラムを用いて4.8gのニンジン膜画分から受容体を精製した結果,SDS-PAGE上で120および150kDの位置にPSK特異的な結合活性を示すタンパク質が得られた.得られたタンパク質の内部アミノ酸配列の解析結果に基づき設計したプライマーを用いて,PCR法による受容体cDNAのクローニングを行なった結果,これらのタンパク質はロイシンリッチリピート型受容体キナーゼの一種であることが明らかとなった.このタンパク質を過剰発現させた細胞では,PSK結合活性の顕著な増加とPSKに対する応答性の向上が確認されたことから,真のPSK受容体であると結論づけられた.

在多细胞生物中，个体细胞之间的通讯在维持个体体内平衡中发挥着重要作用。申请人于1996年发现的PSK是一种自分泌型细胞间通讯因子，推测其参与细胞全能性的调节。植物细胞。在这项研究中，我们旨在阐明 PSK 在个体水平上的作用。使用已显示大量表达PSK受体的培养胡萝卜细胞系，我们检查了受体的溶解条件，发现它是一种常见的表面活性剂，结果表明TX-100能够有效地溶解受体。接下来，我们尝试制备亲和柱来高效纯化受体分子，发现[Lys^5]PSK的侧链结果表明，通过氨基中的间隔基固定在琼脂糖凝胶上的柱对受体显示出高亲和力。使用该柱从4.8g胡萝卜膜级分中纯化受体，结果显示SDS-A蛋白显示出PSK特异性结合。根据获得的蛋白质的内部氨基酸序列的分析结果，获得了PAGE上120和150kD的活性。使用上述设计的引物通过PCR克隆受体cDNA，结果表明这些蛋白质是一种富含亮氨酸的重复受体激酶，在细胞中显着增加PSK结合活性并改善对PSK的反应性。得到证实，得出结论：它是真正的 PSK 受体。