内耳形成後期の半規管形成におけるWntシグナルの機能解析

内耳形成后期半规管形成过程中Wnt信号的功能分析

基本信息

批准号：
10J01348
负责人：
野田哲平
金额：
$ 0.9万
依托单位：
Kyushu University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for JSPS Fellows
财政年份：
2010
资助国家：
日本
起止时间：
2010 至 2011
项目状态：
已结题

项目摘要

前年度に引き続き、未知であったマウス内耳発生後期におけるWntシグナル活性の分布およびその役割について解析を進めた。まず胎生10日～12日胚を詳細に解析することによりWntシグナル活性が経時的に耳胞背側において内側へ限局していくことを見出し、その実体となるリガンドや分泌性抑制因子、転写因子などの発現パターンを明らかにした。その結果から、Wntシグナルの限局がリガンドと抑制因子のバランスによって成り立っていると推察した。次いでWntシグナルの機能解析を、前年度に確立した全胚培養法と薬剤(Wntシグナル経路に特異的に働く阻害剤)を組み合わせた方法で行った。耳胞の形態について三次元再構築を用いて観察したところ、Wntシグナルを亢進させた胚では外側半規管低形成と前後半規管形成遅延という形態異常がみられた。一方Wntシグナルを抑制した胚では著明な形態変化はみられなかった。形態変化のメカニズムを明らかにするため、内耳形成に必須の遺伝子のWntシグナルとの関連について調べた。外側半規管形成に必須な転写因子Otx1がWntシグナルの亢進によって抑制されており、外側半規管低形成はOtx1の発現抑制を介している可能性が考えられた。また、基底膜断片化によって耳胞上皮の癒合消失を担うNetrin1の発現は過剰なWntシグナルによって抑制され、Netrin1と拮抗するLrig3はWntシグナル亢進によって発現領域の拡大がみられたため、これらの相互作用によって担われる半規管形成が、Wntシグナルによって制御されている可能性が示唆された。実際に基底膜の断片化と脱上皮化が、耳胞外側の上皮で起こっており、これらがWntシグナルの亢進によって阻害されることを明らかにした。以上の実験結果から、Wntシグナルが耳胞背側において適切に抑制されることが正常な内耳形態形成に必要である可能性が示唆された。

从上一年开始，我们分析了Wnt信号活性在小鼠内耳发育晚期的未知分布和作用。首先，通过对胚胎10到12天的详细分析，我们发现Wnt信号活性随时间而向内局部位于耳鼻喉科的背侧，并且揭示了配体的表达模式，分泌抑制剂和形成该物质的转录因子。从结果来看，估计Wnt信号的定位基于配体和抑制剂之间的平衡。然后使用一种将在上一年中建立的整个胚胎培养方法与药物（专门在Wnt信号途径上作用的抑制剂）结合的方法进行Wnt信号的功能分析。当使用三维重建观察到耳塞囊泡的形态时，具有Wnt信号增加的胚胎显示出形态异常，例如侧半圆形底管发育不全，并延迟了前侧和外侧管形成的延迟。另一方面，在抑制Wnt信号的胚胎中未观察到显着的形态变化。为了阐明形态变化的机制，我们研究了与内耳形成必不可少的基因的Wnt信号的关联。人们认为OTX1是侧向半圆形管的必不可少的转录因子，通过增加Wnt信号传导抑制了OTX1，并且横向半圆形管下发育不全可能是通过抑制OTX1表达来介导的。此外，Netrin1的表达是导致由于地下膜碎裂而导致的耳盘上皮的尿液丧失的表达，通过过量的Wnt信号传导抑制了与NetRin1拮抗的LRIG3，它通过这些相互作用可能通过这些相互作用来扩展了与Netrin1的拮抗区域，这表明了wnt信号的增加。我们已经表明，基底膜的碎裂和深层化实际上发生在外部oloticulopoda的上皮中，并且这些信号受到增加的Wnt信号的抑制。上述实验结果表明，对于正常的内耳形态发生，可能需要适当抑制耳coll骨的Wnt信号。