ヒト腫瘍免疫レパトアのプロテオミクスプロフィーリング

人类肿瘤免疫库的蛋白质组学分析

• 批准号: 10F00121
• 负责人: 佐藤 昇志
• 金额: $ 1.86万
• 依托单位: Sapporo Medical University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for JSPS Fellows
• 财政年份: 2010
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2010 至 2012
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-10F00121/
• 关键词: MHCクラスI; 抗原提示; 腫瘍抗原ペプチド; 抗原掲示; ERAAP

CD8+T細胞は標的細胞に提示されるペプチド/MHCクラスI複合体を特異的に認識し、これを傷害する。提示される抗原ペプチドは内在性に発現した蛋白に由来する分解産物であるが、これらのペプチドがどのようなメカニズムでつくられ、またどのようなペプチド群(レパートリー)を形成しているのかは未だに不明な点が多い。本プロジェクトではマススペクトロメトリーを利用し実際に提示されてくるMHCクラスIペプチド群の網羅的解析を行う。当該年度では、1)HLA-A24特異抗体産生ハイブリドーマよりモノクローナル抗体を精製濃縮し、ペプチド/HLAクラスI複合体を回収するための親和カラムを作成した。2)約1.5×10^9個のHLA-A24発現するヒト大腸癌細胞株(SW480,Colo320,HCT-15/b2m)より細胞抽出液を準備し、親和カラムでペプチド/HLAクラスI複合体を回収した後、弱酸で結合ペプチドを遊離回収した。3)分子量3kDaフィルターを通した遊離ペプチドをRP-HPLCによりフラクション化し、それぞれのサンプルをマススペクトロメトリー(ABI/4800plusMALDI_TOF/TOF)により網羅的にシークエンス解析した。4)SW480,Colo320,HCT-15/b2mからは重複のない186個、コントロールとして用いたHLA-A24発現しないヒト大腸癌細胞株HCT-116からは5個のペプチド配列を検出した(2013年3月現在)。実験の再現性は約80%程度であり、また既知のHLA-A24結合モチーフを利用した親和性解析では前者のペプチド群が有意に高く、後者はいずれもHLA-A24結合モチーフを欠損していた。この結果は、本システムにより高い精度でがん細胞のHLA-A24に提示されるナチュラルペプチドレパートリーを網羅的解析可能であることを示している。

CD8+ T细胞特别识别并损害了呈现给靶细胞的肽/MHC I类配合物。提出的抗原肽是源自内源表达的蛋白质的降解产物，但仍不清楚这些肽产生了哪些机制以及哪些类型的肽基（曲目）形式。该项目使用质谱法来对实际MHC I类肽组进行全面分析。在今年，1）单克隆抗体被纯化，并从产生HLA-A24特异性抗体的杂交瘤中浓缩，并准备了一个亲和力柱，用于恢复肽/HLA I类配合物。 2）从约1.5×10^9 HLA-A24表达的人类结肠癌细胞系（SW480，COLO320，HCT-15/B2M）中制备细胞提取物，并在亲和力柱上收集了肽/HLA I类配合物，并在较弱的酸酸上及时回收限制性肽。 3）通过RP-HPLC分口通过3KDA分子量过滤器的游离肽，并通过质谱法（ABI/4800PLUSMALDI_TOF/TOF）对每个样品进行全面测序。 4）在SW480，COLO320和HCT-15/B2M中检测到186个肽序列，并从HCT-116中检测到5个未表达HLA-A24的HCT-116，并从HCT-116中检测到5个肽序列，该肽序列被用作对照（2013年3月）。实验可重复性约为80％，在使用已知的HLA-A24结合基序的亲和力分析中，前肽组明显更高，而后者都缺乏HLA-A24结合基序。结果表明，该系统允许对癌细胞中呈现给HLA-A24的天然肽库的全面分析。

项目成果

Efficiency of G2/M-related tumor-associated antigen-targeting cancer immunotherapy depends on antigen expression in the cancer stem-like population

• DOI: 10.1016/j.yexmp.2011.09.016
• 发表时间: 2012-02-01
• 期刊: EXPERIMENTAL AND MOLECULAR PATHOLOGY
• 影响因子: 3.6
• 作者: Mori, Takashi;Nishizawa, Satoshi;Sato, Noriyuki
• 通讯作者: Sato, Noriyuki

The role of phosphopeptides presented on MHC class I

MHC I 类磷酸肽的作用

• 发表时间: 2011
• 作者: Yoshihiko Hirohashi;Toshihiko Torigoe;Satoko Inoda;Rena Morita;Vitaly Kochin;Noriyuki Sato;Vitaly Kochin
• 通讯作者: Vitaly Kochin