破骨細胞分化メカニズムの時空間的解明

破骨细胞分化机制的时空阐明

基本信息

批准号：
21770206
负责人：
竹ヶ原宜子
金额：
$ 2.91万
依托单位：
Osaka University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Young Scientists (B)
财政年份：
2009
资助国家：
日本
起止时间：
2009 至 2010
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-21770206/
关键词：
破骨細胞 podosome small G protein 時空間制御

项目摘要

本研究では、RacのGEFであるFARP2の破骨細胞における役割に注目し、破骨細胞融合というイベントにおけるFARP2の機能をRacの活性化を指標に"時空間的"に明らかにすることにより、破骨細胞の細胞融合を担う分子メカニズムの詳細を明らかにすることを目的とする。マクロファージ株化細胞であるRAW264.7細胞はRANKLの刺激によって容易に破骨細胞へと分化する。GEFドメインを欠損させたドミナントネガティブ型FARP2(ΔGEF-FARP2)をRAW24.7細胞に強制発現させたところ、RANKL刺激による多核破骨細胞への分化障害が認められた。しかしながらこの細胞では破骨細胞分化マーカーであるTRAPやNFATc1といった遺伝子の発現は認められ、破骨細胞分化後期に生じる多核化が障害されていることが明らかとなった。ΔGEF-FARP2発現細胞に認められる破骨細胞多核化障害を詳細に検討した。すると、(1)細胞骨格を形成するアクチン繊維構造が変化し、破骨細胞に認められるPodosome-beltの形成が障害されていた。(2)FRET法を用いて時空間的なRacの活性化を検討し、コントロール細胞で認められたpodosome-beltに特異的なRacの活性化がΔGEF-FARP2発現細胞では認められなかった。(3)ΔGEF-FARP2発現細胞はコントロール細胞に比べてインテグリンの活性が高く、細胞外基質に対する接着活性が顕著に高い、ということが明らかになった。FARP2の破骨細胞における機能をさらに確認するため、FARP2遺伝子欠損マウスを樹立し、in vitroにて破骨細胞分化誘導実験を行った。するとFARP2欠損細胞はRANKL刺激による破骨細胞分化マーカーの発現は正常であるにもかかわらず、多核破骨細胞の形成が障害され、FARP2が破骨細胞多核化に重要な分子であることが明らかとなった。

在本研究中，我们重点研究了FARP2（Rac的GEF）在破骨细胞中的作用，并以Rac激活为指标，阐明了FARP2在破骨细胞“时空”融合事件中的功能。负责破骨细胞融合的分子机制。 RAW264.7细胞是一种巨噬细胞系，通过刺激RANKL很容易分化为破骨细胞。当 RAW24.7 细胞被迫表达缺乏 GEF 结构域的显性失活 FARP2 (ΔGEF-FARP2) 时，观察到 RANKL 刺激后向多核破骨细胞的分化受损。然而，在这些细胞中观察到作为破骨细胞分化标志物的TRAP和NFATc1等基因的表达，表明破骨细胞分化后期发生的多核作用受损。我们详细研究了在表达 ΔGEF-FARP2 的细胞中观察到的破骨细胞多核紊乱。结果，(1)形成细胞骨架的肌动蛋白纤维结构发生变化，破骨细胞中观察到的足体带的形成受到损害。 (2)使用FRET检查时空Rac激活，在对照细胞中观察到的足体带特异性Rac激活在表达ΔGEF-FARP2的细胞中没有观察到。 (3)表明表达ΔGEF-FARP2的细胞比对照细胞具有更高的整合素活性和显着更高的细胞外基质粘附活性。为了进一步证实FARP2在破骨细胞中的功能，我们建立了FARP2基因缺陷小鼠并进行了体外破骨细胞分化诱导实验。尽管在 FARP2 缺陷细胞中，RANKL 刺激后破骨细胞分化标记物的表达正常，但多核破骨细胞的形成受到损害，这表明 FARP2 是破骨细胞多核化的重要分子。