パーオキシナイトライトによるシトクロムC修飾作用のアポトーシス様細胞死への関与

过氧亚硝酸盐对细胞色素 C 的修饰参与凋亡样细胞死亡

• 批准号: 13771417
• 负责人: 中川 秀彦
• 金额: $ 1.28万
• 依托单位: National Institute of Radiological Sciences
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Young Scientists (B)
• 财政年份: 2001
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2001 至 2002
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-13771417/
• 关键词: パーオキシナイトライト; シトクロムc; アポトーシス; ミトコンドリア; チロシンニトロ化; カスパーゼ; 活性酸素種; 蛋白質修飾

1.パーオキシナイトライト処理による細胞内カスパーゼ経路活性化能の検討前年度にin vitroにおけるカズパーゼ-3の活性化について免疫ブロッティング法を用いて解析し、パーオキシナイトライト処理シトクロムcではカスパーゼ-3活性化能が低下していることを見いだした。本年度は神経膠芽腫培養細胞にパーオキシナイトライトを作用させた場合のカスパーゼ-3および上流経路の活性化の有無を免疫ブロッティング法、蛍光性擬似基質の切断活性により検討した。細胞生存率はパーオキシナイトライト濃度依存的に減少したにも関わらず、持続的なパーオキシナイトライト処理によりカズパーゼ-3および-9活性化が抑制されることが示された。また、短時間のパーオキシナイトライト処理ではアポトーシスが進行することが示された。これによりin vitro系に対応する現象が培養細胞系でも観察されたことになる。2.パーオキシナイトライト処理による培養細胞内シトクロムcの修飾反応の解析前年度の検討において、パーオキシナイトライト処理によってラット神経膠芽腫培養細胞内の12〓14kDa付近の蛋白質がニトロ化されることが明らかとなった。培養細胞のパーオキシナイトライト処理によって実際に細胞内のシトクロムcがニトロ化されるか否かを免疫沈降法を用いて検討したところ、パーオキシナイトライト処理により細胞内でシトクロムcがニトロ化されることが示された。さらにin vitro系でニトロ化されたシトクロムcを加水分解し修飾部位を検討したところ、Trp59およびTyr67を含むペプチド断片に変化が観察された。3.無処理シトクロムcを添加した場合のカスパーゼ-3活性化能回復の可能性についての検討パーオキシナイトライト処理神経膠芽腫細胞から細胞抽出液を調整しシトクロムcを添加してカスパーゼ-3活性化能が回復するかを検討したが、活性化は観察されなかった。

1.过氧亚硝酸盐处理激活细胞内caspase途径的能力的检查去年，我们利用免疫印迹法对caspase-3的激活进行了体外分析，结果发现激活能力下降。今年，我们利用免疫印迹法和荧光假底物的裂解活性研究了用过氧亚硝酸盐处理培养的胶质母细胞瘤细胞时 caspase-3 的激活及其上游途径。尽管细胞活力以过氧亚硝酸盐浓度依赖性方式下降，但持续的过氧亚硝酸盐处理可抑制 caspase-3 和 -9 活化。研究还表明，短期过氧亚硝酸盐处理可促进细胞凋亡。这意味着在培养细胞系统中也观察到了与体外系统相对应的现象。 2.过氧亚硝酸盐处理对培养细胞中细胞色素c的修饰反应分析在前一年的研究中，过氧亚硝酸盐处理对培养的大鼠胶质母细胞瘤细胞中12-14kDa左右的蛋白质进行了硝化。当我们使用免疫沉淀法检查细胞内的细胞色素c实际上是否通过过氧亚硝酸盐处理培养细胞而被硝化时，我们发现细胞内的细胞色素c通过过氧亚硝酸盐处理被硝化。此外，当硝化细胞色素c在体外系统中水解并检查修饰位点时，在含有Trp59和Tyr67的肽片段中观察到变化。 3.添加未处理的细胞色素c时恢复caspase-3活化能力的可能性的检查从过氧亚硝酸盐处理的胶质母细胞瘤细胞制备细胞提取物，并添加细胞色素c以活化caspase-3，我们研究了活化能力是否会恢复。恢复，但未观察到激活。