歯胚発育障害における基底膜型ヘパラン硫酸プロテオグリカンの役割

基底膜型硫酸乙酰肝素蛋白多糖在牙胚发育障碍中的作用

基本信息

批准号：
13771071
负责人：
依田浩子
金额：
$ 1.28万
依托单位：
Niigata University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Young Scientists (B)
财政年份：
2001
资助国家：
日本
起止时间：
2001 至 2002
项目状态：
已结题

项目摘要

今年度は前年に引き続き、正常歯胚組織の発育過程におけるin vivoでの基底膜型ヘパラン硫酸プロテオグリカン・パールカン(HSPG)の局在を明らかにする目的で,各歯胚発育段階のマウス下顎第一臼歯歯胚(胎生11,13,15,17日齢,生後1,6,10,12,28日齢)について,パラフィン連続切片をもちいて,HSPGコア蛋白質の局在およびHSPG遺伝子発現を免疫組織化学的およびin-situハイブリダイゼーション法にて検索した。その結果,HSPGコア蛋白質は,エナメル器および歯乳頭組織に局在し,とくに,エナメル髄星状網細胞の細胞間隙にきわめて豊富であった。鐘状期歯胚では,エナメル基質形成開始期に限局して,内エナメル芽細胞の細胞基底側および側面の細胞間隙にHSPG免疫陽性の小胞状拡張が出現し,周囲の内エナメル髄細胞にHSPG遺伝子発現がみられた。同時に,象牙芽細胞にもHSPG遺伝子発現が強く認められた。したがって,HSPGがそれらの細胞分化あるいはエナメル髄内の拡散による物質輸送の担体としてエナメル質・象牙質基質合成に関与している可能性が示唆された(裏面研究発表2-4)。また,歯胚組織由来とされるエナメル上皮腫においても,エナメル髄様の腫瘍胞巣内にHSPGが特異的高濃度に局在するとともに,腫瘍胞巣浸潤先端部でとくに遺伝子発現が強調されたので,上皮性腫瘍細胞の増殖や浸潤を制御している可能性が示唆された(研究発表1)。ついで,歯胚の各構成細胞でのHSPGコア蛋白質の生合成を確認する目的で,歯小嚢・歯乳頭・エナメル髄細胞の初代培養システムを確立し,蛍光抗体法および免疫沈降法,さらにRT-PCR法によって検討したところ,すべての細胞種においてHSPGの蛋白質およびmRNAレベルでの発現が確認された(研究発表4)。最後にHSPGの関与する歯胚発育障害機構を解明する目的で,アンチセンスHSPGオリゴヌクレオチド添加・非添加下にて歯胚器官培養をおこなった。アンチセンス添加群の培養歯胚紐織では,エナメル器の発育および象牙芽細胞分化が不良であることが確認されており,HSPGがエナメル芽細胞および象牙芽細胞分化に重要な役割をはたしていることがin vitroでも明らかになった。

继上一年的基础上，本财年我们将继续关注为了阐明基底膜型硫酸乙酰肝素蛋白多糖（HSPG）在体内的定位，我们研究了牙胚发育各个阶段（胚胎第11、13、15和17天，出生后）的小鼠下颌第一磨牙牙胚。天）。1,6,使用石蜡连续切片，使用免疫组织化学和原位杂交方法研究 10、12 和 28 日龄时 HSPG 核心蛋白的定位和 HSPG 基因表达。结果表明，HSPG核心蛋白定位于牙釉质器官和牙乳头组织中，尤其在牙髓星状网状细胞的细胞间隙中极其丰富。在钟形牙胚中，HSPG免疫阳性的囊泡延伸出现在内部成釉细胞基底和侧面的细胞间隙中，位于牙釉质基质形成的开始，并且HSPG免疫阳性细胞出现在周围的内部成釉细胞中。观察到表达。同时，在成牙本质细胞中强烈观察到HSPG基因表达。因此，有人认为HSPGs可能作为细胞分化的载体或通过牙髓内扩散进行物质运输的载体参与牙釉质和牙本质基质的合成（封底的研究报告2-4）。此外，在被认为源自牙胚组织的成釉细胞瘤中，HSPG在牙釉质髓质瘤巢内以特定的高浓度存在，并且基因表达在瘤巢侵入的尖端特别强调。表明它可能控制上皮肿瘤细胞的增殖和侵袭（研究报告1）。接下来，为了确认牙胚各组成细胞中HSPG核心蛋白的生物合成，我们建立了牙囊、牙乳头和牙髓细胞的原代培养体系，并进行了荧光抗体和免疫沉淀方法。作为 RT。-PCR 分析的结果是，在所有细胞类型中均证实了 HSPG 在蛋白质和 mRNA 水平上的表达（研究演示 4）。最后，为了阐明涉及HSPG的牙胚发育障碍的机制，在添加和不添加反义HSPG寡核苷酸的情况下进行牙胚器官培养。证实反义补充组培养的牙胚索组织中牙釉质器官发育和成牙本质细胞分化较差，这表明HSPG在体外也揭示了成釉细胞和成牙本质细胞分化中的重要作用。