Rad51依存的な二重鎖切断修復を制御する新規化合物の探索とその作用機序

寻找控制Rad51依赖性双链断裂修复的新化合物及其作用机制

基本信息

批准号：
09J03499
负责人：
石田恭子
金额：
$ 1.28万
依托单位：
Waseda University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for JSPS Fellows
财政年份：
2009
资助国家：
日本
起止时间：
2009 至 2010
项目状态：
已结题

项目摘要

〈研究の目的〉本研究では、DNA相同組換えタンパク質Rad51の活性を制御し得る低分子化合物の探索と、その作用機序を明らかにすることを目的としている。Rad51遺伝子を欠損させたマウスは胎生致死となり、一方でRad51を過剰発現させたニワトリ由来のDT40細胞では、染色体異常が観察される。さらに、種々のガン細胞においてRad51の発現量の変化が報告されていること、また、その発現量の変化がガン細胞の悪性化に関与しているとの報告もされている。以上のことから、Rad51は、細胞の恒常性維持において大変重要な役割を担っていると考えられる。よって、Rad51の活性や発現量の制御を可能とする化合物の同定は、細胞のガン化を防ぐ、もしくは悪性化したガン細胞の増殖を抑制する技術への発展に期待できる。<研究方法>Rad51は、DNA相同組換えにおいて最も重要な反応である、相同鎖対合及び相同鎖交換を触媒する。そこで、それぞれの反応を試験官内で再現した、D-loopアッセイ及びStrand Exchangeアッセイを化合物存在下で行い、化合物のRad51活性への効果を判定した。〈研究成果〉これまでに申請者は、Rad51と直接結合することでRad51の組換え活性を著しく阻害する化合物4,4'-diisothiocyanostilbene-2,2'-disulfonic acid(以下DIDSと略)を同定している。しかし、細胞にDIDSを添加すると細胞致死となり、in vitroでのRad51に対するDIDSの阻害効果を検証することが出来なかった。そこで、我々は新たに海綿抽出液から得られた化合物を用いて、再度上記アッセイ法により化合物のスクリーニングを行った。その結果、Rad51の組換え活性を阻害するhalenaquinoneを発見した。生化学的解析から、halenaquinoneもDIDSと同様に、Rad51と直接結合しRad51の組換え活性を阻害することが明らかとなった。さらに、halenaquinoneは、Rad51のダメージ依存的なフォーカス形成を阻害することが分かった。一方で、halenaquinoneとRad51との結合強度は、DIDSとRad51とのそれに比べ低く、Rad51のフォーカス形成を阻害するには高濃度のhalenaquinoneを必要とした。そこで、Rad51-DIDS及びRad51-halenaquinone複合体の共結晶を作製し、結晶構造解析を行うことで、それぞれの利点を組み合せた新規化合物のデザインを目指す。

<研究的目标>本研究旨在寻找可以控制DNA同源重组蛋白RAD51活性的小分子化合物，并阐明作用机理。缺乏RAD51基因的小鼠是胚胎致死的，而在过表达Rad51的鸡的DT40细胞中观察到染色体异常。此外，在各种癌细胞中已经报道了RAD51表达水平的变化，还报道了表达水平的变化与癌细胞的恶性转化有关。基于上述，据信RAD51在维持细胞稳态中起着非常重要的作用。因此，可以预期可以鉴定允许控制RAD51活性和表达水平的化合物，以防止细胞癌变或抑制恶性癌细胞的增殖。 <Research方法> RAD51催化DNA同源重组中最重要的反应：同源链配对和同源链交换。因此，在存在测试仪中复制每个反应的化合物的情况下，进行了D环和链交换测定，并确定了化合物对RAD51活性的影响。研究结果：迄今为止，申请人已经确定了4,4'-二甲硫代乙醇2,2,2'-二磺酸的化合物（本文缩写为DIDS），这通过直接与Rad51的结合直接抑制了Rad51的重组活性。但是，将DID添加到细胞中导致细胞致死性，而DIDS对RAD51体外的抑制作用无法验证。因此，我们使用了从海绵提取物中使用新近获得的化合物，以使用上述测定方法再次筛选。结果，Halenaquinone抑制了RAD51的重组活性。生化分析表明，与DIDS一样，Halenaquinone直接与RAD51结合并抑制RAD51的重组活性。此外，发现哈雷纳酮抑制了rad51中损伤依赖性的焦点形成。另一方面，哈雷纳酮和rad51之间的结合强度低于dids和rad51之间的结合强度，并且需要高浓度的halenaquinone来抑制rad51中的焦点形成。因此，通过制备RAD51-DIDS和RAD51-HALENAQUINONE复合物的共结晶并进行晶体结构分析，我们旨在设计结合每种优势的新化合物。

项目成果

期刊论文数量（0）

专著数量（0）

科研奖励数量（0）

会议论文数量（0）

专利数量（0）

新規RAD51活性化因子GEMIN2の相同組換え修復における機能

新型 RAD51 激活剂 GEMIN2 在同源重组修复中的功能

DOI：
发表时间：
2010
期刊：
影响因子：
0
作者：
高久誉大;滝沢由政;辻田幹;石田恭子;両角佑一;胡桃坂仁志
通讯作者：
胡桃坂仁志

GEMIN2によるRAD51組換え活性の制御

GEMIN2 对 RAD51 重组活性的调节

DOI：
发表时间：
2009
期刊：
影响因子：
0
作者：
高久誉大;滝沢由政;辻田幹;石田恭子;両角佑一;胡桃坂仁志
通讯作者：
胡桃坂仁志

低分子化合物によるRAD51依存的相同組換え反応の制御

低分子量化合物控制 RAD51 依赖性同源重组反应

DOI：
发表时间：
2010
期刊：
影响因子：
0
作者：
石田恭子;他
通讯作者：
他

DIDS, a chemical compound that inhibits RAD51-mediated homologous pairing and strand exchange.

DOI：
10.1093/nar/gkp200
发表时间：
2009-06
期刊：
Nucleic acids research
影响因子：
14.9
作者：
Ishida T;Takizawa Y;Kainuma T;Inoue J;Mikawa T;Shibata T;Suzuki H;Tashiro S;Kurumizaka H
通讯作者：
Kurumizaka H

低分子化合物を用いた組換え修復タンパク質RAD51の活性制御

使用低分子量化合物调节重组修复蛋白 RAD51 的活性