Exploring new functions of DNA polymerase zeta using plant-cell systems

利用植物细胞系统探索 DNA 聚合酶 zeta 的新功能

基本信息

批准号：
20K12174
负责人：
坂本綾子
金额：
$ 2.83万
依托单位：
National Institutes for Quantum Science and Technology
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
财政年份：
2020
资助国家：
日本
起止时间：
2020-04-01 至 2024-03-31
项目状态：
已结题

项目摘要

DNAポリメラーゼζ(Polζ)を欠損したシロイヌナズナの変異体(rev3-1)は放射線に対して感受性を示すことから、植物のPolζがDNA二重鎖切断修復に関与していることが示唆されているが、その証拠は得られていない。本研究ではシロイヌナズナおよびヒメツリガネゴケを材料に用いてPolζの新規機能の探索を行うことを目的としている。R4年度は、ヒメツリガネゴケのDNA二重鎖切断修復に関わる経路の解析と、シロイヌナズナPolζの小サブユニットであるREV7とGFPとの融合タンパク質を発現する形質転換植物の作成を行った。1) ヒメツリガネゴケでは相同組換えに必須なRAD51Bを欠損すると放射線抵抗性が大きく下がることがわかっている。今回、RAD51Bに加えオルタナティブエンドジョイニング(alt-EJ)に関わるPOLQを欠損させた二重変異体のガンマ線に対する感受性を解析したところ、RAD51B単独変異よりもさらに放射線抵抗性が低下することがわかった。2) APRT遺伝子座をマーカーとして用いた変異スペクトル解析では、RAD51Bを欠損すると繰り返しを含む欠失・挿入変異が多く検出されている。今回、RAD51BとPOLQの二重欠損変異体の変異スペクトルを解析したところ、通常のPCRでは捕捉できない大きな構造変化が頻繁に生じることがわかった。このことから、ヒメツリガネゴケのDNA二本鎖切断修復では相同組換えに次いでalt-EJが重要なことが示唆された。3) Polζの新規機能を解明する目的でPolζの小サブユニットであるREV7とGFPとの融合タンパク質を発現するコンストラクトをREV7欠損株に導入し、rev7バックグラウンドの指標であるマイトマイシンC感受性が相補されることを確認した。また、蛍光顕微鏡による観察でGFP融合タンパク質がシロイヌナズナ細胞の核及び細胞質で発現することを確認した。

缺乏DNA聚合酶ζ（POLζ）的拟南芥突变体（Rev3-1）对辐射敏感，这表明植物中的Polζ与DNA双链断裂修复有关，但没有获得此证据。这项研究旨在使用拟南芥和同胞苔藓作为材料来探索波尔ζ的新功能。在第4财年，我们分析了窦苔藓中DNA双链断裂修复的途径，并创建了一种转化的植物，该植物在Rev7（Rev7）（拟南芥POLζ的小亚基）和GFP之间表达融合蛋白。 1）已经发现，Rad51b的缺乏对于同源重组至关重要，可显着降低窦苔藓中的辐射耐药性。在这项研究中，我们分析了与伽马射线相关的替代内部加入（ALT-EJ）缺乏POLQ的双突变体的敏感性，并发现与单独的RAD51B相比，辐射阻力进一步降低。 2）使用APRT基因座作为标记物的突变频谱分析揭示了许多缺失和插入突变，包括丢失RAD51B时重复使用。在这项研究中，我们分析了RAD51B和POLQ的双缺陷突变体的突变光谱，发现经常发生正常PCR无法捕获的巨大结构变化。这表明Alt-EJ在同源重组后的DNA双链破裂修复中最重要。 3）为了阐明POLζ的新功能，将Rev7（Polζ的小亚基）和GFP之间表达融合蛋白的构建体引入了REV7缺陷菌株中，并证实了丝霉素C敏感性是Rev7背景的指示。此外，通过荧光显微镜观察证实，GFP融合蛋白在拟南芥细胞的细胞核和细胞质中表达。