低温菌生体膜における低温適応を支える分子基盤解明 : エイコサペンタエン酸の生理機能解析

阐明耐冷细菌生物膜低温适应的分子基础：二十碳五烯酸的生理功能分析

• 批准号: 09J02396
• 负责人: 佐藤 翔
• 金额: $ 1.79万
• 依托单位: Kyoto University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for JSPS Fellows
• 财政年份: 2009
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2009 至 2011
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-09J02396/
• 关键词: EPA; 脂質修飾タンパク質; プローブ; クリックケミストリー; マイクロドメイン; リン脂質プローブ; リン脂質-タンパク質間相互作用; 低温菌; 分子プローブ; エーテル型リン脂質

これまでリン脂質アシル鎖としてのEPAの機能に着目してプローブを作製してきたが、平成22年度の研究でEPA含有リン脂質特異的に結合するタンパク質として同定されたDcpホモログがリポタンパク質である可能性が示されたようにEPAがタンパク質修飾剤として特異な生理機能をもつ可能性も考えられた。EPAのようなLPUFA修飾タンパク質に関する報告は、ほ乳類においては一部なされているものの少なくともバクテリアにおいて報告例はない。しかしながら、平成21年度の研究でEPA含有リン脂質が濃縮されたマイクロドメインの存在が示されたことでマイクロドメイン指向性のEPA修飾タンパク質の存在が期待された。そこでEPA修飾タンパク質探索用ツールとしてクリックケミストリーを利用して検出や同定が可能なω-アルキニルEPA(clickable EPA, cEPA)を合成した。cEPAはEPA欠損株の4℃での生育遅延を野生株レベルまで完全に回復させた。これは天然のEPAと同様の結果であったことからcEPAはEPAと同様の生理機能を有すると考えられた。次に、cEPAを添加した培地で4℃にて培養後、回収した菌体から不溶性および可溶性タンパク質を調製し、各々をアジドクマリンで蛍光標識後、SDS-PAGEに供し、In-gel検出を行った。その結果、7つのEPA修飾タンパク質を不溶性タンパク質群から検出した。さらに、これらの同定を目指し、アジドビオチンを用いてビオチン標識タンパク質を調製し、ストレプトアビジンによるアフィニティー精製を行った。SDS-PAGE後のゲル上で濃縮されたバンドに対しペプチドマスフィンガープリンティング解析を行った結果、同定されたタンパク質の一つが2-1で見出されたDcpホモログであることがわかった。DcpホモログはEPA修飾を受けるリポタンパク質の一つであることがより強く示唆された。DcpホモログへのEPA分子の付与によって、Dcpホモログの膜親和性・膜局在性が促進され、代謝回転が速いと考えられる細胞分裂サイトでの膜タンパク質の分解系を調節していることが考えられた。

探针是通过关注EPA作为磷脂酰基链的功能来制备的，但是正如2010年的一项研究表明，DCP同源物被确定为特异性结合含有磷脂的EPA的蛋白质，它是脂蛋白，也认为EPA可能具有独特的物理学功能，可以作为蛋白质修饰。关于LPUFA改性蛋白（例如EPA）的报告已在哺乳动物中部分发表，但至少在细菌中没有报道。然而，预计在2009年的一项研究中，存在富含EPA的磷脂的微域的存在，预计有微分指导的EPA修饰蛋白的存在。因此，合成了ω-碱基EPA（可单击的EPA，CEPA），可以使用Click Chemistry作为搜索EPA修饰蛋白的工具来检测和识别。 CEPA完全恢复了4°C时EPA缺陷菌株的生长延迟至野生应变水平。该结果与天然EPA相似，因此人们认为CEPA具有与EPA相似的生理功能。接下来，在添加了4°C的CEPA培养基中培养后，从收集的细胞中制备了不溶性和可溶性蛋白，并用荧光标记为偶氮蛋白酶，然后对SDS-PAGE进行SDS-PAGE检测以检测到凝胶。结果，从不溶性蛋白基团中检测到七个EPA修饰的蛋白质。此外，旨在鉴定这些生物素标记的蛋白质使用氮杂蛋白制备，并用链霉亲和素进行亲和力纯化。 SDS-PAGE后，对凝胶上的浓缩带进行了肽质量指纹分析，发现其中一种已鉴定的蛋白是在2-1中发现的DCP同源物。更强烈建议DCP同源物是经历EPA修饰的脂蛋白之一。据认为，在DCP同源物中添加EPA分子会促进DCP同源物的膜亲和力和定位，并调节细胞分裂位点膜蛋白的降解系统，其中细胞被认为具有快速离职。

项目成果

蛍光標識エーテル型リン脂質を用いたEPA含有リン脂質のダイナミクス解析

使用荧光标记的醚型磷脂对含 EPA 磷脂进行动力学分析

• 发表时间: 2010
• 作者: Sato SB;Sato S;Kawamoto J;Kurihara T;佐藤翔;佐藤翔;佐藤翔
• 通讯作者: 佐藤翔

エイコサペンタエン酸含有エーテル型リン脂質の合成

含二十碳五烯酸的醚型磷脂的合成

• 发表时间: 2009
• 作者: Sato SB;Sato S;Kawamoto J;Kurihara T;佐藤翔;佐藤翔;佐藤翔;佐藤翔;佐藤翔;佐藤翔;佐藤翔
• 通讯作者: 佐藤翔

Development of phospholipid probes with polyunsaturated hydrocarbon chain to analyze distribution and interacting proteins on bacterial membrane

开发具有多不饱和烃链的磷脂探针来分析细菌膜上的分布和相互作用蛋白质

• 发表时间: 2012
• 作者: Sato SB;Sato S;Kawamoto J;Kurihara T;佐藤翔
• 通讯作者: 佐藤翔

合成分子プローブを用いたEPA含有リン脂質の動的挙動の解析

使用合成分子探针分析含 EPA 磷脂的动态行为

• 发表时间: 2010
• 作者: Sato SB;Sato S;Kawamoto J;Kurihara T;佐藤翔;佐藤翔
• 通讯作者: 佐藤翔

エイコサペンタエン酸含有エーテル型リン脂質の合成とその評価

含二十碳五烯酸的醚型磷脂的合成与评价

• 发表时间: 2010
• 作者: Sato SB;Sato S;Kawamoto J;Kurihara T;佐藤翔;佐藤翔;佐藤翔;佐藤翔;佐藤翔;佐藤翔
• 通讯作者: 佐藤翔