低温菌生体膜における低温適応を支える分子基盤解明 : エイコサペンタエン酸の生理機能解析

阐明耐冷细菌生物膜低温适应的分子基础：二十碳五烯酸的生理功能分析

基本信息

批准号：
09J02396
负责人：
佐藤翔
金额：
$ 1.79万
依托单位：
Kyoto University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for JSPS Fellows
财政年份：
2009
资助国家：
日本
起止时间：
2009 至 2011
项目状态：
已结题

项目摘要

これまでリン脂質アシル鎖としてのEPAの機能に着目してプローブを作製してきたが、平成22年度の研究でEPA含有リン脂質特異的に結合するタンパク質として同定されたDcpホモログがリポタンパク質である可能性が示されたようにEPAがタンパク質修飾剤として特異な生理機能をもつ可能性も考えられた。EPAのようなLPUFA修飾タンパク質に関する報告は、ほ乳類においては一部なされているものの少なくともバクテリアにおいて報告例はない。しかしながら、平成21年度の研究でEPA含有リン脂質が濃縮されたマイクロドメインの存在が示されたことでマイクロドメイン指向性のEPA修飾タンパク質の存在が期待された。そこでEPA修飾タンパク質探索用ツールとしてクリックケミストリーを利用して検出や同定が可能なω-アルキニルEPA(clickable EPA, cEPA)を合成した。cEPAはEPA欠損株の4℃での生育遅延を野生株レベルまで完全に回復させた。これは天然のEPAと同様の結果であったことからcEPAはEPAと同様の生理機能を有すると考えられた。次に、cEPAを添加した培地で4℃にて培養後、回収した菌体から不溶性および可溶性タンパク質を調製し、各々をアジドクマリンで蛍光標識後、SDS-PAGEに供し、In-gel検出を行った。その結果、7つのEPA修飾タンパク質を不溶性タンパク質群から検出した。さらに、これらの同定を目指し、アジドビオチンを用いてビオチン標識タンパク質を調製し、ストレプトアビジンによるアフィニティー精製を行った。SDS-PAGE後のゲル上で濃縮されたバンドに対しペプチドマスフィンガープリンティング解析を行った結果、同定されたタンパク質の一つが2-1で見出されたDcpホモログであることがわかった。DcpホモログはEPA修飾を受けるリポタンパク質の一つであることがより強く示唆された。DcpホモログへのEPA分子の付与によって、Dcpホモログの膜親和性・膜局在性が促進され、代謝回転が速いと考えられる細胞分裂サイトでの膜タンパク質の分解系を調節していることが考えられた。

迄今为止，已创建的探针主要关注 EPA 作为磷脂酰基链的功能，但 2010 年研究中被鉴定为与含有 EPA 的磷脂特异性结合的蛋白质的 Dcp 同源物可能是一种脂蛋白也有人认为EPA作为蛋白质调节剂可能具有独特的生理功能。尽管已经有一些关于哺乳动物中的LPUFA修饰的蛋白质（例如EPA）的报道，但至少在细菌中还没有报道。然而，2009 年的研究表明存在富含 EPA 磷脂的微结构域，从而引发了对微结构域定向 EPA 修饰蛋白存在的预期。因此，我们合成了可检测和鉴定的ω-炔基EPA（可点击EPA，cEPA），利用点击化学作为寻找EPA修饰蛋白的工具。 cEPA将EPA缺陷菌株在4℃下的生长迟缓完全恢复到野生型菌株的水平。由于该结果与天然EPA的结果相似，因此认为cEPA具有与EPA相同的生理功能。接下来，在添加有cEPA的培养基中于4℃下培养后，从收集的细胞中制备不溶性和可溶性蛋白质，将每种蛋白质用叠氮香豆素进行荧光标记，然后进行SDS-PAGE和凝胶内检测。结果，从不溶性蛋白质组中检测到7种EPA修饰蛋白质。此外，为了鉴定这些蛋白质，使用叠氮生物素制备生物素标记的蛋白质，并使用链霉亲和素亲和纯化。对SDS-PAGE后凝胶上浓缩的条带进行肽质量指纹分析，结果发现所鉴定的蛋白质之一是2-1中发现的Dcp同源物。这强烈表明Dcp同源物是经过EPA修饰的脂蛋白之一。据认为，EPA 分子与 Dcp 同系物的附着促进了它们的膜亲和力和膜定位，并调节了细胞分裂位点的膜蛋白降解系统，在该处，细胞分裂位点被认为是快速的。

项目成果

期刊论文数量（0）

专著数量（0）

科研奖励数量（0）

会议论文数量（0）

专利数量（0）

蛍光標識エーテル型リン脂質を用いたEPA含有リン脂質のダイナミクス解析

使用荧光标记的醚型磷脂对含 EPA 磷脂进行动力学分析

DOI：
发表时间：
2010
期刊：
影响因子：
0
作者：
Sato SB;Sato S;Kawamoto J;Kurihara T;佐藤翔;佐藤翔;佐藤翔
通讯作者：
佐藤翔

エイコサペンタエン酸含有エーテル型リン脂質の合成

含二十碳五烯酸的醚型磷脂的合成

DOI：
发表时间：
2009
期刊：
影响因子：
0
作者：
Sato SB;Sato S;Kawamoto J;Kurihara T;佐藤翔;佐藤翔;佐藤翔;佐藤翔;佐藤翔;佐藤翔;佐藤翔
通讯作者：
佐藤翔

Development of phospholipid probes with polyunsaturated hydrocarbon chain to analyze distribution and interacting proteins on bacterial membrane

开发具有多不饱和烃链的磷脂探针来分析细菌膜上的分布和相互作用蛋白质

DOI：
发表时间：
2012
期刊：
影响因子：
0
作者：
Sato SB;Sato S;Kawamoto J;Kurihara T;佐藤翔
通讯作者：
佐藤翔

Differential roles of internal and terminal double bonds in docosahexaenoic acid : Comparative study of cytotoxicity of polyunsarurated fatty acids to HT-29 human colorectal tumor cell line

二十二碳六烯酸内部和末端双键的不同作用：多不饱和脂肪酸对HT-29人结直肠肿瘤细胞系细胞毒性的比较研究

DOI：
发表时间：
2011
期刊：
Prostaglandins Leukot Essent Fatty Acids
影响因子：
0
作者：
Sato SB;Sato S;Kawamoto J;Kurihara T
通讯作者：
Kurihara T

合成分子プローブを用いたEPA含有リン脂質の動的挙動の解析

使用合成分子探针分析含 EPA 磷脂的动态行为

DOI：
发表时间：
2010
期刊：
影响因子：
0
作者：
Sato SB;Sato S;Kawamoto J;Kurihara T;佐藤翔;佐藤翔
通讯作者：
佐藤翔

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尾崎典雅,梅田悠平,佐藤友子,ALBERTAZZ　Bruno,BENUZZI MOUNAIX Alessandra,BOLIS Riccardo,GUARGUAGINI Marco,片桐健登,兒玉了祐,KOENIG Michel,宮西宏併,森岡慎太郎,西川豊人,大井修吾,RAVASIO Alessandra,坂和洋一,佐野孝好,関根利守