消化器固形癌特異的発現トランスポーターLST-2を用いた癌指向性抗癌剤の開発

利用胃肠道实体瘤特异性表达转运蛋白LST-2开发癌症定向抗癌药物

• 批准号: 13218011
• 负责人: 阿部 高明
• 金额: $ 4.74万
• 依托单位: Tohoku University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas (C)
• 财政年份: 2001
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2001 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-13218011/
• 关键词: トランスポーター; アデノウィルス; 感受性私権; 抗癌剤; 有機アニオン

申請者は最近単離した新規有機アニオントランスポーターLST-1に引き続きLST-2を世界に先駆けて単離した。LST-2は正常ヒト肝臓のみに弱く発現していたが胃癌、大腸癌、膵臓癌において多量に発現していた。各種発現系の結果からLST-2はMTXを飽和的にかつ濃度依存的に輸送し培養細胞へのLST-2遺伝子の導入は細胞のMTXに対する感受性を高めることが明らかとなった。本研究ではアデノウイルスを用いたLST-2強制発現細胞を作製し、その発現細胞に取り込まれる蛍光標識物質の蛍光強度に対する各種薬物の阻害効率を指標に消化器固形癌指向性薬物の探索を目的とする。我々はアデノウイルスを用いたトランスポーターの強制発現系を樹立し、蛍光マイクロタイタープレートを用いてLST-2で輸送される蛍光基質の取り込みの抑制を指標とした消化器固形癌指向性薬物のスクリーニング系の開発を行った。動物細胞で働くCAGプロモーターを含むcosmid vector, pAxCAwtにLST-1,LST-2c DNAの翻訳領域を挿入、アデノウイルスゲノムDNAと共にリン酸カルシウム法でHEK293細胞にcotransfectionし、LST-1,LST-2組み換えアデノウイルス(AdLST-1,AdLST-2)を得た。AdLST-1,AdLST-2を各種細胞株に感染させ、放射線標識体の取り込み実験を行った。AdLST-1,AdLST-2を感染させたHepG2,PLC/PRF/5,HT17で[3H]-タウロコール酸(TCA)の取り込みを検討したところ、コントロールに対して最大36.7倍の有意な取り込みが認められた。AdLST-1,AdLST-2の感染により発現したLST-1及びLST-2は共に濃度依存的、飽和的にTCAを取り込んだ。また、ケノデオキシコール酸(CDCA)はLST-2によって濃度依存的飽和的に取り込まれ、そのKm値は0.66+0.11μMであり非常に親和性の高い基質であることがわかり、機能的にも効果的に細胞にLST-2を導入することが可能になった。

继最近分离出新型有机阴离子转运蛋白LST-1之后，申请人在全球首次分离出LST-2。 LST-2仅在正常人肝脏中微弱表达，但在胃癌、结直肠癌和胰腺癌中大量表达。各种表达系统的结果表明，LST-2以饱和且浓度依赖性的方式转运MTX，并且将LST-2基因引入培养细胞中增加了细胞对MTX的敏感性。本研究利用腺病毒产生LST-2强制表达细胞，并以各种药物对表达细胞内掺入的荧光标记物质的荧光强度的抑制效率为指标，寻找针对胃肠道实体癌的药物应该是。我们利用腺病毒建立了转运蛋白的强制表达系统，并以LST-2转运的荧光底物的摄取抑制为指标，使用荧光微量滴定板筛选针对胃肠道实体癌的药物。发达。将LST-1和LST-2c DNA的翻译区插入pAxCAwt（一种在动物细胞中起作用的含有CAG启动子的粘粒载体），并使用磷酸钙法与腺病毒基因组DNA共转染至HEK293细胞中，产生LST-1和LST-2c DNA。获得LST-2重组腺病毒(AdLST-1、AdLST-2)。我们用AdLST-1和AdLST-2感染各种细胞系，并进行放射性标记物质摄取的实验。当我们检查感染 AdLST-1 和 AdLST-2 的 HepG2、PLC/PRF/5 和 HT17 中 [3H]-牛磺胆酸 (TCA) 的摄取时，我们观察到显着摄取高达对照的 36.7 倍完成了。通过AdLST-1和AdLST-2感染表达的LST-1和LST-2均以浓度依赖性和饱和方式吸收TCA。此外，鹅去氧胆酸（CDCA）以浓度依赖性且饱和的方式被LST-2摄取，其Km值为0.66+0.11μM，表明其是高亲和力底物并且在功能上有效成为可能。将LST-2引入细胞中。

项目成果

Sugiyama D., Kusuhara H., Shitara Y., Abe T., et al.: "Characterization of the efflux transport of 17beta-estradiol-D-17beta-glucuronide from the brain across the blood-brain barrier"J Pharmacol Exp Ther. 298. 316-322 (2001)

Sugiyama D.、Kusuhara H.、Shitara Y.、Abe T. 等人：“17β-雌二醇-D-17β-葡萄糖醛酸从大脑穿过血脑屏障的流出转运的表征”J Pharmacol Exp Ther

Takeuchi A., Masuda S., Saito H., Abe T., Inui K.: "Multispecific substrate recognition of kidney-specific organic anion transporers OAT-K1 and OAT-K2"J Pharmacol Exp Ther. 299. 1-7 (2001)

Takeuchi A.、Masuda S.、Saito H.、Abe T.、Inui K.：“肾脏特异性有机阴离子转运蛋白 OAT-K1 和 OAT-K2 的多特异性底物识别”J Pharmacol Exp Ther。

Fujiwara K., Adachi H., Nishio T., Tokui T., Okabe M., Abe T.et al.: "Isolation of a novel human organic anion transporting polypeptide OATP-E which transports thyroid hormone"Endocrinology. 142. 2005-2012 (2001)

Fujiwara K.、Adachi H.、Nishio T.、Tokui T.、Okabe M.、Abe T.等人：“分离运输甲状腺激素的新型人体有机阴离子运输多肽 OATP-E”内分泌学。

Nakai D., Nakagomi R., Furuta F., Tokui T., Abe T., Ikeda T., Nishimura K.: "Human Liver-specific Organic Anion Transporter, LST-1,Mediates Uptake of Pravastatin by Human Hepatocytes"J Pharmacol Exp Ther.. 295. 861-867 (2001)

Nakai D.、Nakagomi R.、Furuta F.、Tokui T.、Abe T.、Ikeda T.、Nishimura K.：“人肝脏特异性有机阴离子转运蛋白，LST-1，介导人肝细胞对普伐他汀的摄取”J

阿部高明, 海野倫明, 徳井太郎: "有機アニオントランスポーター oatp/LSTとその機能"蛋白核酸酵素. 46. 612-620 (2001)

Takaaki Abe、Michiaki Unno、Taro Tokui：“有机阴离子转运蛋白 OATP/LST 及其功能”蛋白质核酸酶 46. 612-620 (2001)。