微小変化型ネフローゼ症候群の発症にノンコーディング RNAは関与するか？

非编码 RNA 是否参与微小病变肾病综合征的发生？

基本信息

批准号：
21K08247
负责人：
高木陽子
金额：
$ 2.58万
依托单位：
Gunma University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
财政年份：
2021
资助国家：
日本
起止时间：
2021-04-01 至 2024-03-31
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-21K08247/
关键词：
微小変化型ネフローゼ症候群ノンコーディングRNA nc886 ポドサイト

项目摘要

昨年度までに、健常ヒトポドサイト細胞株におけるnc886遺伝子領域のDNAメチル化率の解析と、健常ヒトポドサイト細胞株における感染モデルとNSモデルでの nc886の発現解析を行った。今年度は、nc886が蛋白尿発現するポドサイト機能にどのように関与しているか検討するために、Poly(I:C)を用いた感染モデル、患者検体を用いたNSモデル、nc886ノックダウンポドサイトにおいて、蛋白尿発現時のポドサイト形態の特徴を示すかについての検討を開始した。感染モデルにおいて、ファロイジンの蛍光染色を用い、アクチンストレスファイバーの変化を検討したところ、Poly(I:C)刺激1時間後に、アクチン重合の減少を認めた。次に、nc886ノックダウンポドサイトにおいて同様の検討を行うために、siRNAを用いてnc886ノックダウンポドサイト細胞株の作成を試みた。siRNA導入後にRt-PCR法を用いてnc886発現を確認したが、未分化増殖期のポドサイト細胞株では有意なnc886の発現低下が得られなかった。そこで、HEK293T細胞におけるnc886ノックダウンを試みたところ、nc886発現低下を得られた。また、nc886が機能的にノックダウンされているか確認するために、nc886発限低下によりPKR活性が進むことから、Western blotting法を用いて、PKR活性を測定した。siRNAを導入したHEK293T細胞では、negative controlと比較してPKRが活性化していた。現在、再現性があるか検討中である。

直到去年，我们分析了健康人足细胞系中nc886基因区域的DNA甲基化率，并分析了健康人足细胞系感染模型和NS模型中nc886的表达情况。今年，为了研究nc886如何参与表达蛋白尿的足细胞的功能，我们将使用Poly(I:C)建立感染模型，使用患者样本建立NS模型，并开始研究nc886敲低的足细胞。足细胞形态是否表现出蛋白尿的特征。在感染模型中，使用鬼笔环肽荧光染色检查肌动蛋白应力纤维的变化，并在用 Poly(I:C) 刺激 1 小时后观察到肌动蛋白聚合减少。接下来，为了对 nc886 敲低足细胞进行类似的研究，我们尝试使用 siRNA 创建 nc886 敲低足细胞细胞系。尽管在引入siRNA后使用Rt-PCR确认了nc886表达，但在未分化生长期的足细胞细胞系中未观察到nc886表达的显着降低。因此，当我们尝试敲低 HEK293T 细胞中的 nc886 时，我们能够减少 nc886 的表达。此外，为了确认nc886是否被功能性敲低，使用蛋白质印迹法测量PKR活性，因为PKR活性由于nc886表达减少而进展。在转染 siRNA 的 HEK293T 细胞中，与阴性对照相比，PKR 被激活。我们目前正在研究它是否可重现。