N-WASPと相互作用する新規蛋白質p55による細胞形態の制御

与 N-WASP 相互作用的新型蛋白质 p55 调节细胞形态

• 批准号: 01J11080
• 负责人: 加藤 真良
• 金额: $ 1.28万
• 依托单位: Chiba University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for JSPS Fellows
• 财政年份: 2001
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2001 至 2002
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-01J11080/
• 关键词: WICH; N-WASP; アクチン重合; アクチンコメット; アクチン架橋

最初にin vitroにおけるWICH(p55)のN-WASP活性化能について検討するため、WICHの組み換え蛋白質を昆虫細胞にGST融合蛋白質として大量発現させ、精製した。実験に影響を及ぼす可能性のあるGSTはプレシジョンプロテアーゼ処理して除いた。そしてN-WASP、Arp2/3複合体やピレン標識したアクチンも調製し、蛍光分光光度計を使ってアクチン重合実験を行った。その結果、WICH存在下でN-WASPはアクチン重合を促進した。また、N-WASPがアクチン重合を促進するとアクチンコメット形成を促進することが知られているので、そこにおけるWICHの関連性についても検討した。N-WASPをコートしたプラスチックビーズを蛍光標識したアクチンを加えた牛脳細胞抽出液中に入れ、蛍光顕微鏡でビーズを観察した結果、ビーズはWICH存在下で、より長いアクチンコメットを形成して抽出液中を泳いだ。以上よりWICHがN-WASPを活性化し、アクチン重合を促進することが明らかとなった。次にWICH自身がアクチンに及ぼす影響を調べた。まず、精製したWICHとアクチンを使って共沈殿実験を行ったところ、WICHによりアクチンは架橋され高次構造をとっている可能性が示唆された。また蛍光標識したファロイジンを使い、その時のアクチンの形態を蛍光顕微鏡にて観察したところ、束化されたアクチンの存在が認められた。ここでWICHのアクチン束化能について検討するため、WICHにアクチン結合部位が複数存在するか、自身が二量体以上の複合体を形成するかをゲル濾過法など用いての解析を試みた。しかしそれらの方法はWICHの場合には適さず、WICHのアクチン束化能については結論を出すに至っていない。最後にWICHのin vivoでの機能解析を試みた。脳、腸、胃、肺の組織切片を凍結切片法で作製し、免疫蛍光抗体法を用いてWICHの局在を調べたところ、脳では海馬、小脳の顆粒細胞とプルキンエ細胞、腸、胃、肺では平滑筋細胞に高発現が認められた。現在これらの細胞の初代培養を行って機能解析を試みているが未だ新たな知見は得られていない。

首先，为了检测WICH (p55)在体外激活N-WASP的能力，我们在昆虫细胞中以GST融合蛋白的形式表达大量重组WICH蛋白并对其进行纯化。通过精密蛋白酶处理去除了可能影响实验的GST。我们还制备了N-WASP、Arp2/3复合物和芘标记的肌动蛋白，并使用荧光分光光度计进行了肌动蛋白聚合实验。结果，N-WASP 在 WICH 存在下促进肌动蛋白聚合。此外，由于已知 N-WASP 在促进肌动蛋白聚合时会促进肌动蛋白彗星的形成，因此我们还研究了 WICH 在这方面的相关性。将N-WASP包被的塑料珠放入含有荧光标记肌动蛋白的牛脑细胞提取物中，在荧光显微镜下观察珠子，结果表明，在WICH存在的情况下，珠子形成更长的肌动蛋白彗星并被提取。我在液体里游泳。由上可知，WICH激活N-WASP并促进肌动蛋白聚合。接下来，我们研究了 WICH 本身对肌动蛋白的影响。首先，我们使用纯化的WICH和肌动蛋白进行了共沉淀实验，这表明肌动蛋白可能被WICH交联并呈现出更高阶的结构。此外，当使用荧光标记的鬼笔环肽在荧光显微镜下观察肌动蛋白的形态时，观察到成束的肌动蛋白的存在。在这里，为了检查WICH的肌动蛋白捆绑能力，我们尝试使用凝胶过滤方法分析WICH是否具有多个肌动蛋白结合位点以及它是否与二聚体以上形成复合物。然而，这些方法并不适合 WICH，并且关于 WICH 的肌动蛋白捆绑能力尚未得出结论。最后，我们尝试分析WICH在体内的功能。采用冰冻切片法制备脑、肠、胃和肺的组织切片，并采用免疫荧光抗体法研究WICH的定位。在脑中，WICH定位于海马、颗粒细胞和浦肯野细胞。小脑、肠、胃、肺平滑肌细胞中观察到高表达。目前，我们正在尝试对这些细胞进行原代培养并分析其功能，但尚未获得新的发现。