BKチャネル開口薬の探索

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基本信息

批准号：
21510124
负责人：
竹内裕子
金额：
$ 2.5万
依托单位：
Osaka University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
财政年份：
2009
资助国家：
日本
起止时间：
2009 至 2010
项目状态：
已结题

项目摘要

[BKチャネルの合成と蛍光標識]昆虫細胞の抽出液を用いて非細胞系でのBKチャネルタンパクの発現を試みた。現在まで真核生物のチャネルを無細胞タンパク合成系で作成した報告はほとんどないが、この方法が確立されれば非天然型アミノ酸の導入も容易であり特定の部位を標識でき、BKチャネルの構造と機能連関を詳細に調べることが可能になる。昨年まで発現が確認できたものは、短いものが多く、全長のものが得られなかった。そのためにsignal sequenceを挿入したが、結果的に大きな変化がなかった。今年度はWesternのための資料調製の条件を検討し、低温処理を施すことにより、今まで見えていなかった全長のBKチャネルを確認することができた。しかし、発現効率が低いという問題は残っており、今後の検討課題である。[BKチャネルの一分子イメージング]BKチャネル一分子の電気的・光学的同時計測のための基本的な装置はすでに出来ているが、本研究では、より安定した効率の良い計測装置の開発を行うことも目的としている。今年度はチャネルタンパクの不動化と再構築の効率化をはかるため、新しい方法をBKチャネルに応用した。ガラス表面をビオチン化したPEGでコーティングし、人工脂質膜に再構成したBKチャネル(豚の子宮から調製)を接近させた。その際、BKチャネルは一次、二次抗体、ビオチン・アビジン結合を介してビオチン化PEGと結合させた。BKチャネルの脂質膜上での動きはcy5で蛍光標識して調べ、抗体存在下でのBKチャネル一分子の不動化を確認することが出来た。PEGコートを用いた研究は、今年度、Langmuirに発表した。これらの方法を用いることにより、今後、一分子で一定時間安定して電気的・光学的同時計測を行えることが期待される。

[BK通道的合成和荧光标记] 我们尝试使用昆虫细胞提取物在非细胞系统中表达BK通道蛋白。迄今为止，利用无细胞蛋白质合成系统创建真核通道的报道还很少，但如果这种方法建立，将很容易引入非天然氨基酸并标记特定位点，并且BK通道的结构可以详细研究函数关系。直到去年，许多能够确认表达的植物都很矮，无法获得全长植物。为此，我插入了一个信号序列，但结果并没有发生重大变化。今年，我们检查了Western的材料准备条件，通过低温处理，我们能够确认迄今为止不可见的全长BK通道。然而，表达效率低的问题仍然存在，是未来研究的课题。【BK通道的单分子成像】同时对BK通道的单分子进行电学和光学测量的基础设备已经被创建出来，但在这项研究中，我们将开发一种更稳定、更高效的测量设备，这也是目的。。今年，我们在BK通道上应用了一种新方法，以提高通道蛋白固定和重建的效率。玻璃表面涂有生物素化的 PEG，并将重建的 BK 通道（从猪子宫制备）靠近人工脂质膜。此时，BK 通道通过一抗和二抗以及生物素/亲和素结合与生物素化 PEG 结合。使用 cy5 荧光标记研究了 BK 通道在脂质膜上的运动，并且我们能够确认在抗体存在的情况下单个 BK 通道分子的固定。使用 PEG 涂层的研究今年发表在 Langmuir 上。通过使用这些方法，预计未来将有可能在一定时间内稳定地对单个分子进行同时电学和光学测量。