3β-HSD欠損症に特有な多重抱合型胆汁酸異常代謝物の構造決定と臨床診断法の確立

确定3β-HSD缺乏症特异性异常多结合胆汁酸代谢物的结构并建立临床诊断方法

• 批准号: 20750141
• 负责人: 柿山 玄太
• 金额: $ 2.25万
• 依托单位: Nihon University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Young Scientists (B)
• 财政年份: 2008
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2008 至 2009
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-20750141/
• 关键词: 先天性胆汁酸代謝異常症; 3β-HSD欠損症; ニーマン・ピック病C1型; 異常胆汁酸多重抱合体; LC-MS; 内部標準物質; ジオキシラン; 遠隔酸化反応

先ず、患者尿の予備的LC-MS分析の結果から、-連の"異常胆汁酸多重抱合体"は、3β, 7β-dihydroxy-5-cholenoic acidの3-硫酸, 7-Nーアセチルグルコサミン, 24-グリシン(あるいはタウリン)抱合体を基本とし、これに水酸基やオキソ基が付加したもの数種が存在することが予測された。先ず、本化合物群の合成に取り掛かることとした。目的とする多重抱合体はいずれも3β,7β-dihydroxy-Δ^5構造を有し、互いに構造が酷似する。このような代謝物相互の高効率合成には原料ステロイドへの位置、並びに立体選択的な水酸基の導入法の確立がポイントとなるものと考えられた。そこで、同じ3β-hydroxy-Δ^5構造を有するコレステロールを用いて、ジオキシラン類による一段階遠隔水酸化反応法について検討を加えた。その結果、ethyl(trifiuoromethyl)dioxiraneを反応系中でin siru発生させると、最も簡便かつ高効率にコレスタン側鎖のC-25位を直接酸化できることを見出した。さらに、得られた25-ヒドロキシコレステロールから、種々の生体内オキシステロール類(24-ヒドロキシコレステロール, 24-オキソコレステロール等)へ短段階で導くルートも併せて開拓した。ここで得られた知見を基に、次いで33-hydroxy-Δ^5胆汁酸を原料として一連の胆汁酸多重抱合体の標品合成を行なった。また、LC-ESI/MS法で生体試料中の微量物質を高精度に定量するには、適切な内部標準化合物(IS)が必須となる。そこで、IS候補化合物数種を分子設計して化学合成を行ない、これを用いてELSD-HPLCによる目的多重抱合体のプレリミナリーな分析条件を検討した。その結果、3β-sulfooxy-7β-hydroxy-24-nor-5β-cholanoic acidをISとして用いるとき至適分析条件が確立できることが判明した。現在、LC-ESI/MSにて分析メソッドのバリデーションを行うと共に、生体試料から標的多重抱合体の効率的な抽出条件にも検討を加えている最中である。

首先，根据对患者尿液的初步LC-MS分析结果，发现“异常胆汁酸复合物”是3β硫酸盐，7β-二羟基-5-胆烯酸，7-N-乙酰氨基葡萄糖，据预测，存在几种基于具有羟基或氧代基团的24-甘氨酸（或牛磺酸）缀合物的缀合物。首先，我们决定合成这组化合物。目标多重缀合物均具有 3β,7β-二羟基-Δ^5 结构，并且结构彼此非常相似。为了高效合成此类相互代谢物，人们认为建立一种将位置和立体选择性的羟基引入原料类固醇的方法被认为是关键。因此，我们研究了一种使用具有相同 3β-羟基-Δ^5 结构的胆固醇的二氧杂环己烷的一步远程羟基化反应方法。结果，我们发现胆甾烷侧链的C-25位可以最简单且高效地直接氧化，在反应体系中原位生成乙基（三氟甲基）二环氧乙烷。此外，我们还开发了一种将所获得的25-羟基胆固醇在短时间内转化为各种体内氧化胆固醇（24-羟基胆固醇、24-氧代胆固醇等）的路线。基于此处获得的知识，我们接下来以 33-羟基-Δ^5 胆汁酸为原料合成了一系列标准胆汁酸复合物。此外，为了使用 LC-ESI/MS 方法准确定量生物样品中的痕量物质，适当的内标化合物 (IS) 至关重要。因此，我们设计并化学合成了几种IS候选化合物，并用它们研究了ELSD-HPLC对目标多结合物的初步分析条件。结果发现，使用 3β-磺氧基-7β-羟基-24-正-5β-胆烷酸作为内标物时可以建立最佳分析条件。我们目前正在使用 LC-ESI/MS 验证分析方法，并且还在研究从生物样品中有效提取目标多重缀合物的条件。

项目成果

LC/ESI-MS^nによる尿中硫酸抱合型テトラヒドロコルチコステロイドの直接一斉分析

通过 LC/ESI-MS^n 直接同时分析尿液中硫酸盐结合的四氢皮质类固醇

• 发表时间: 2008
• 作者: 沖原梨香;長谷川真紀;三田村邦子;柿山玄太;飯田隆;清水力;池川繁男
• 通讯作者: 池川繁男

LC/MSによる硫酸抱合型オキシステロール高感度定量法の開発

开发一种使用 LC/MS 定量硫酸盐共轭氧甾醇的高灵敏度方法

• 发表时间: 2009
• 作者: 三田村邦子;貴田亜希子;吉岡慎司;河本里鶴;武藤晃奈;柿山玄太;飯田隆;村井毅;黒澤隆夫;Hirotoshi Fude;Charles A. Strott;池川繁男
• 通讯作者: 池川繁男

Isolation, Identification, and chemical synthesis of novel bile acids in vertebrates

脊椎动物中新型胆汁酸的分离、鉴定和化学合成

• 发表时间: 2008
• 作者: Kakiyama G;Iida T;Muto A;Mano N;Goto J;Hagey L.R;Hofmann A. F
• 通讯作者: Hofmann A. F

in situ発生ジオキシランの遠隔含酸素官能基化反応を利用したオキシステロール類の短段階合成

利用原位生成的双环氧乙烷的远程含氧官能化反应短步合成氧甾醇

• 发表时间: 2008
• 作者: 柿山 玄太;飯田 隆;他4名
• 通讯作者: 他4名

アカハネシギダチョウ胆汁から新規高級胆汁酸の単離と同定

红翅鸵鸟胆汁中新型高级胆汁酸的分离与鉴定

• 发表时间: 2009
• 作者: 柿山 玄太;飯田 隆;他4名
• 通讯作者: 他4名