腎マクラデンサ細胞のゲノミクスとプロテオミクス

肾 Macradensa 细胞的基因组学和蛋白质组学

• 批准号: 20659136
• 负责人: 河原 克雅
• 金额: $ 1.98万
• 依托单位: Kitasato University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Challenging Exploratory Research
• 财政年份: 2008
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2008 至 2010
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-20659136/
• 关键词: TGF機構; マクラデンサ細胞; プロスタグランジンE_2; MALDI-TOF-MS; macula densa; nNOS; microarray analysis; aldosterone; dexamethasone; furosemide; nitric oxide; MALDI-TOF MS; reductase domain; calmodulin binding site

株化したマクラデンサ細胞(NE-MD細胞)において、遺伝子(DNAマイクロアレイ解析)と機能タンパク(アガロース2次元電気泳動、MALDI-TOF-MS)の解析を行った。NE-MD細胞に12μM furosemide(Furo)を添加後、当該遺伝子の発現量をコントロールと比較した。その結果、COX-2,EP4(PGE_2受容体)遺伝子の発現量は経時的に増加し、各々1.4倍に増加した(120分)。NE-MD細胞では、細胞外[Cl^-]を低下させたり、FuroでCl^-輸送体(NKCC2)を阻害したりしなくても、forskolin(For)添加によって細胞内cAMP濃度を上昇させることにより、COX-2発現が亢進した。一方、Cl^-freeでCOX-2発現が亢進している状態では、For添加による相加的な発現亢進は認められなかったが、H-89添加によって発現亢進が抑えられることから、cAMP-PKA系が重要な役割を担っていることが明らかになった。また、RT-PCRの結果、4つのEP受容体アイソフォーム(EP1-EP4)の内、EP4の発現を確認した。また、PGE_2のEC_<50>=4.52nM(NE-MD細胞)は、CHO細胞の数値(3.91+/-0.31nM:Nishigaki N et al,1996)に近似していた。さらに、NE-MD細胞外に5pMPGE_2を添加すると、COX-2発現量が有意に増加した(5hr後)が、EP4受容体アンタゴニスト(AH-23848)存在下では、Cl^-free誘導PGE_2産生量は大幅に低下した。一方、Cl^-free刺激によりEP4の発現量が増加する点も重要である。通常、EP4受容体にPGE_2が感作すると脱感作が起こるが、NE-MD細胞では、Cl-free刺激によりPGE_2産生が増えて細胞膜表面上のEP4受容体に感作してもEP4発現が亢進した。以上の結果から、COX-2発現調節におけるEP4を介した正のフィードバック機構は、TGF機構の修飾が長期にわたる場合でも、安定してPGE_2を供給するために非常に重要であると考えられる。最後に,NE-MD細胞のFuro誘導タンパク質をアガロース2次元電気泳動で展開し、MALDI-TOF-MSで解析した。発現が増加したタンパク質としてサイトケラチン(CK)18と19を同定した。CK18とCK19(上皮細胞に発現する中間径フィラメントの構成要素)は、細胞の強度維持に必要である。

基因（DNA微阵列分析）和功能蛋白（琼脂糖二维电泳，MALDI-TOF-MS）在应e应激的摩酸细胞（NE-MD细胞）中分析。将12μM速尿（FURO）添加到NE-MD细胞中后，将基因的表达水平与对照进行了比较。结果，随着时间的推移，COX-2和EP4（PGE_2受体）基因的表达水平增加，每个基因的表达水平增加了1.4倍（120分钟）。在NE-MD细胞中，通过在不降低细胞外[Cl^ - ]的情况下增加细胞内cAMP的浓度来增加COX-2的表达，或用Furo抑制Cl^ - 转移者（NKCC2）。另一方面，当无Cl^fre cox-2表达增加时，由于添加了FOR，未观察到表达的添加剂增加，但是H-89的添加抑制了表达的增加，这清楚地表明CAMP-PKA系统起着重要作用。此外，RT-PCR证实了四个EP受体同工型中EP4的表达（EP1-EP4）。此外，PGE_2的EC_ <50> = 4.52 nm（NE-MD细胞）近似CHO细胞值（3.91 +/- 0.31 nm：Nishigaki N等，1996）。此外，在NE-MD细胞之外的下午5点添加了5pmpge_2显着提高了COX-2表达水平（5小时后），但是在存在EP4受体拮抗剂（AH-23848）的情况下，Cl-Free诱导的PGE_2产生水平显着降低。另一方面，重要的是，无Cl^ - free刺激会增加EP4的表达水平。通常，当PGE_2对EP4受体敏感时，会发生脱敏，但是在NE-MD细胞中，PGE_2由于无CL刺激而增加，即使当细胞膜表面上的EP4受体在EP4受体上，EP4表达也会增加。基于上述结果，人们认为通过EP4调节COX-2表达的正反馈机制对于稳定提供PGE_2非常重要，即使TGF机制的修改是长期的。最后，通过琼脂糖2D电泳开发了来自NE-MD细胞的FURO诱导的蛋白质，并通过MALDI-TOF-MS分析。细胞角蛋白（CK）18和19被鉴定为表达增加的蛋白质。需要CK18和CK19（在上皮细胞中表达的中间丝的成分）才能维持细胞强度。

项目成果

Prostaglandin E_2 stimulates the expression of COX-2 in mouse macula densa cell line.

前列腺素 E_2 刺激小鼠致密斑细胞系中 COX-2 的表达。

• 发表时间: 2011
• 作者: Fukuda H.;Kawahara K.
• 通讯作者: Kawahara K.

A role of V1a receptor(V1aR)in water/electolyes metabolism : Electrolytes balance in mice lacking V1aR mice lacking V1aR.

V1a 受体 (V1aR) 在水/电解质代谢中的作用：缺乏 V1aR 的小鼠中的电解质平衡 缺乏 V1aR 的小鼠。

• 发表时间: 2009
• 作者: 小林瑞佳;安岡有紀子;田上昭人;河原克雅;岡本浩嗣
• 通讯作者: 岡本浩嗣

A role of V1a receptor(V1aR)in renal H+ excretion : Acid-base balance in mice lacking V1aR.

V1a 受体 (V1aR) 在肾 H 排泄中的作用：缺乏 V1aR 的小鼠的酸碱平衡。

• 发表时间: 2009
• 作者: 安岡有紀子;小林瑞佳;田上昭人;河原克雅
• 通讯作者: 河原克雅

A role of V1aR in acid-base balance.

V1aR 在酸碱平衡中的作用。

• 发表时间: 2010
• 作者: Yasuoka Y.;Kawahara K.
• 通讯作者: Kawahara K.

腎と透析 特集:アンモニア代謝と酸塩基調節NH3/NH4+の尿細管輸送経路と髄質内蓄積

肾脏与透析专题：氨代谢和酸碱调节NH3/NH4+肾小管转运途径和髓内积累

• 发表时间: 2009
• 作者: 河原克雅;福田英一;小林瑞佳
• 通讯作者: 小林瑞佳