ミオシンVの正確な歩幅決定プロセスのマイクロ秒追跡

微秒级跟踪肌球蛋白V精确步长测定过程

基本信息

批准号：
20770121
负责人：
西川宗
金额：
$ 2.83万
依托单位：
Osaka University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Young Scientists (B)
财政年份：
2008
资助国家：
日本
起止时间：
2008 至无数据
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-20770121/
关键词：
ミオシンV ミオシンVI 暗視野顕微鏡金粒子分解能ハロタグ A

项目摘要

本年度の研究目標は「新しい暗視野顕微鏡法の時空間分解能の評価と改善」および「金粒子の固定法の確立」であった. 第1の目標に関しては, 我々は全反射照明を応用した新しい暗視野顕微鏡技術を確立しスペックルや干渉縞の問題を解決した. 結果, 40nmの金プローブでは100μ秒, 80nmでは10μ秒の時間分解能でオングストローム単位の空間分解能を実現した. 第2の目標に関しては, ミオシンVのモータードメイン(N末端)にハロタグを用いたビオチンラベル法を確立し, アビジン標識した金プローブを効率よく結合することが可能になった. これらを用いて歩幅決定プロセスのマイクロ秒追跡を行い, 以下が明らかになった.ミオシンVは80nmのステップを実現するために, まず50nm地点で16m秒だけ停留し±40nmの範囲をくまなく探索する. 停留地点から30nm先の最適位置を検出した後は, 300μ秒以内にステップ反応を終了する. 同様の方法論を用いて, ミオシンVIは2種類のフォワードステップをもつことが明らかになった. 80nmステップは50nm地点で停留し, 40nmステップは10nm地点で停留する. これはミオシンVIの軸足の向きが2種類存在することを意味し, 同時にバックステップを含む多彩な歩行様式メカニズムも明らかになった.

今年的研究目标是“评估和提高新型暗场显微镜方法的时空分辨率”和“建立金颗粒固定方法”。关于第一个目标，我们正在开发一种新方法我们建立了暗场显微镜技术，解决了散斑和干涉条纹的问题。最终，我们实现了埃单位的空间分辨率，40 nm金探针的时间分辨率为100 μs，10 nm金探针的时间分辨率为10 μs。 80 nm 时为 μs。关于第二个目标，我们建立了一种使用肌球蛋白 V 的运动域（N 末端）上的晕环标签的生物素标记方法，并且可以有效地结合亲和素标记的金探针，我们在微秒内跟踪了决策过程。发现如下：为了实现 80 nm 步长，肌球蛋白 V 首先在 50 nm 点停止 16 m 秒，并搜索 ±40 nm 的整个范围。在检测到停止点之前 30 nm 的最佳位置后，步进反应在 300 μs 内完成，使用类似的方法，发现肌球蛋白 VI 有两种类型的向前步进：80 nm 步进在 50 nm 点停止。 40nm 的步长停在 10nm 点，这意味着肌球蛋白 VI 的轴有两个方向，同时，还揭示了包括后退在内的各种步态风格机制。