ミオシンVの正確な歩幅決定プロセスのマイクロ秒追跡

微秒级跟踪肌球蛋白V精确步长测定过程

基本信息

批准号：
20770121
负责人：
西川宗
金额：
$ 2.83万
依托单位：
Osaka University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Young Scientists (B)
财政年份：
2008
资助国家：
日本
起止时间：
2008 至无数据
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-20770121/
关键词：
ミオシンV ミオシンVI 暗視野顕微鏡金粒子分解能ハロタグ A

项目摘要

本年度の研究目標は「新しい暗視野顕微鏡法の時空間分解能の評価と改善」および「金粒子の固定法の確立」であった. 第1の目標に関しては, 我々は全反射照明を応用した新しい暗視野顕微鏡技術を確立しスペックルや干渉縞の問題を解決した. 結果, 40nmの金プローブでは100μ秒, 80nmでは10μ秒の時間分解能でオングストローム単位の空間分解能を実現した. 第2の目標に関しては, ミオシンVのモータードメイン(N末端)にハロタグを用いたビオチンラベル法を確立し, アビジン標識した金プローブを効率よく結合することが可能になった. これらを用いて歩幅決定プロセスのマイクロ秒追跡を行い, 以下が明らかになった.ミオシンVは80nmのステップを実現するために, まず50nm地点で16m秒だけ停留し±40nmの範囲をくまなく探索する. 停留地点から30nm先の最適位置を検出した後は, 300μ秒以内にステップ反応を終了する. 同様の方法論を用いて, ミオシンVIは2種類のフォワードステップをもつことが明らかになった. 80nmステップは50nm地点で停留し, 40nmステップは10nm地点で停留する. これはミオシンVIの軸足の向きが2種類存在することを意味し, 同時にバックステップを含む多彩な歩行様式メカニズムも明らかになった.

今年的研究目标是“评估和改善新的黑场显微镜的时空分辨率”和“建立固定金颗粒的方法”。关于第一个目标，我们使用总反射照明建立了一种新的黑场显微镜技术，以解决斑点和干扰条纹的问题。结果，我们在40 nm金探头的时间分辨率为100μsec和10μsec的埃克斯特罗姆中实现了空间分辨率，用于80 nm。关于第二个目标，我们使用Halotag建立了一种生物素标记方法，该方法是肌球蛋白V的运动结构域（N-末端），这使得有效结合Avidin标记的金探针成为可能。使用这些，我们对步幅长度确定过程进行了微秒跟踪，并显示了以下内容。肌球蛋白V是实现80 nm的一步。首先，50 nm停止16毫秒，并彻底搜索±40 nm范围。在检测到距离停止点30 nm的最佳位置后，步骤反应在300μsec内完成。使用类似的方法，据揭示肌球蛋白VI有两个正向步骤。 80 nm步骤停在50 nm，40 nm步骤停在10 nm处。这意味着肌球蛋白VI有两个不同的方向，并且已经揭示了各种步行模式。