高濃度の蛍光ATPを用いた1分子ATP加水分解イメージング

使用高浓度荧光 ATP 进行单分子 ATP 水解成像

基本信息

批准号：
19042015
负责人：
西川宗
金额：
$ 3.2万
依托单位：
Osaka University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
财政年份：
2007
资助国家：
日本
起止时间：
2007 至 2008
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-19042015/
关键词：
ミオシン 1分子 FRET 量子ドット ATP 合成 1 分子

项目摘要

全反射蛍光顕微鏡法により1分子観測することが可能となったが, 観察蛍光分子の濃度は50nM程に限られる。申請者が提案する「量子ドット(以下QD)と蛍光共鳴エネルギー移動(以下FRET)を組み合わせた1分子イメージング手法」は、観察蛍光分子の濃度を従来の200倍まで引き上げることが可能である。本手法はミオシンに標識したQD(ドナー)とCy3-ATP(アクセプター)間のFRETにより実証する. QDとヌクレオチドポケットの距離を可能な限り短縮するため, QDの粒子径とミオシンへの標識方法を検討した. まず12アミノ酸からなる短鎖ペプチドで表面処理したペプチドコートQDを作成した。短鎖ペプチドは, QDに配位結合するポリシステインと親水性アミノ酸からなり、結果として粒子径の小さな親水性QDが得られる. 次に、ミオシンVの270番目のリジンをシステインに置換した変異体(K270C)を作成した。K270Cのシステイン残基のチオール基とコートペプチドのアミノ末端を架橋することで、ペプチドコートQDとミオシンVの特異的近接結合を実現した。作成したQDミオシンVをカバーガラスに固定し、Cy3-ATPの加水分解を高濃度1分子イメージングしたところ, Cy3とQDの蛍光強度は逆相関を示し、ヌクレオチドの結合解離をFRETのクライテリアで検出できた。ヌクレオチドの解離速度は, ミオシンVのMg ATPase rate(0.02〜0.03 S-1)に一致した. また, 試行錯誤の過程でCaATPase(0.07s^<-1>)がMg ATPaseの約3倍速いことが明らかになったため, Ca存在下での高濃度1分子イメージングを行ったところ, 期待通りの速い解離速度が検出できた.

一个分子可以观察到总反射荧光显微镜，但是观察荧光分子的浓度限制为约50 nm。申请人提出的“将量子点（QD）和荧光共振能（FRET）相结合的“一种 - 分子成像方法”可以将观察荧光分子的浓度提高到200倍。 QD（供体）和CY3-ATP（登录器）在Miosin指示的QD和核苷酸口袋之间的距离之间证明了这一方法。 Miocin。短链肽是由聚体和亲水性氨基酸组成的，这些氨基酸与QD结合，导致颗粒直径为小的亲水性QD。 Pepperide Coat QD和Miosin V具有特定的接近度，可以通过交联K270C半胱氨酸残基的氨基末端来实现与肽涂层QD和Miosin V的特定接近性。当创建的QD Miosin V固定在盖玻片上并且CY3-ATP的水解为1分子成像的高浓度时，Cy3和QD的荧光强度表明可以用核苷酸的逆相关性检测到核苷酸的结合。 fret标准。核苷酸的断开速度与肌球蛋白V的Mg ATPase速率（0.02-0.03 s-1）一致。在试验和误差时，肌球蛋白V。CAATPase（0.07S^<-1>）的速度比MG ATPase快3倍揭示，如预期的那样，检测到Ca的存在中的高浓度1分子成像。