高濃度の蛍光ATPを用いた1分子ATP加水分解イメージング

使用高浓度荧光 ATP 进行单分子 ATP 水解成像

• 批准号: 19042015
• 负责人: 西川 宗
• 金额: $ 3.2万
• 依托单位: Osaka University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
• 财政年份: 2007
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2007 至 2008
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-19042015/
• 关键词: ミオシン; 1分子; FRET; 量子ドット; ATP 合成; 1 分子; ミオシン; 1分子; FRET; 量子ドット; ATP 合成; 1 分子

全反射蛍光顕微鏡法により1分子観測することが可能となったが, 観察蛍光分子の濃度は50nM程に限られる。申請者が提案する「量子ドット(以下QD)と蛍光共鳴エネルギー移動(以下FRET)を組み合わせた1分子イメージング手法」は、観察蛍光分子の濃度を従来の200倍まで引き上げることが可能である。本手法はミオシンに標識したQD(ドナー)とCy3-ATP(アクセプター)間のFRETにより実証する. QDとヌクレオチドポケットの距離を可能な限り短縮するため, QDの粒子径とミオシンへの標識方法を検討した. まず12アミノ酸からなる短鎖ペプチドで表面処理したペプチドコートQDを作成した。短鎖ペプチドは, QDに配位結合するポリシステインと親水性アミノ酸からなり、結果として粒子径の小さな親水性QDが得られる. 次に、ミオシンVの270番目のリジンをシステインに置換した変異体(K270C)を作成した。K270Cのシステイン残基のチオール基とコートペプチドのアミノ末端を架橋することで、ペプチドコートQDとミオシンVの特異的近接結合を実現した。作成したQDミオシンVをカバーガラスに固定し、Cy3-ATPの加水分解を高濃度1分子イメージングしたところ, Cy3とQDの蛍光強度は逆相関を示し、ヌクレオチドの結合解離をFRETのクライテリアで検出できた。ヌクレオチドの解離速度は, ミオシンVのMg ATPase rate(0.02〜0.03 S-1)に一致した. また, 試行錯誤の過程でCaATPase(0.07s^<-1>)がMg ATPaseの約3倍速いことが明らかになったため, Ca存在下での高濃度1分子イメージングを行ったところ, 期待通りの速い解離速度が検出できた.

尽管可以通过总反射荧光显微镜观察一个分子，但是观察到的荧光分子的浓度限制为约50 nm。申请人的建议“一种将量子点（以下称QD）和荧光共振能量传递（以下称重）相结合的单分子成像技术，可以将观察到的荧光分子的浓度增加到200倍的传统方法。该方法由肌蛋白固定QD（Donor）和cy3-atep（donor）和cy3-Atep（quse）（Qy3-Atep）（Q.D-Atep）（Qy3-Atep）进行了qudect（Q.D）。我们尽可能地研究了QD的粒径，并用肌球蛋白标记的方法是用12个氨基酸组成的短链肽质量QD （K270C）创建了肌球蛋白V的第270位位置的赖氨酸，通过将K270C的半胱氨酸残基和大衣肽的氨基末端的硫醇组交联，并在肽蛋白QD和肌球蛋白V之间进行特定的近似结合。创建的QD肌球蛋白V固定在盖玻片上，并以高浓度的一个分子成像Cy3-ATP的水解。 CY3和QD的荧光强度显示出反相关性，并且可以通过FRET标准检测到核苷酸结合解离。核苷酸的解离速率与肌球蛋白V的Mg ATPase速率（0.02-0.03 s-1）一致。此外，据表明，在试验和错误期间，当高浓度的单个分解率是在cap的情况下，随着ca的表现，CAATPase（0.07S^<-1>）比MG ATPase快于MG ATPase的速度快三倍。