高濃度の蛍光ATPを用いた1分子ATP加水分解イメージング

使用高浓度荧光 ATP 进行单分子 ATP 水解成像

基本信息

批准号：
19042015
负责人：
西川宗
金额：
$ 3.2万
依托单位：
Osaka University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
财政年份：
2007
资助国家：
日本
起止时间：
2007 至 2008
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-19042015/
关键词：
ミオシン 1分子 FRET 量子ドット ATP 合成 1 分子

项目摘要

全反射蛍光顕微鏡法により1分子観測することが可能となったが, 観察蛍光分子の濃度は50nM程に限られる。申請者が提案する「量子ドット(以下QD)と蛍光共鳴エネルギー移動(以下FRET)を組み合わせた1分子イメージング手法」は、観察蛍光分子の濃度を従来の200倍まで引き上げることが可能である。本手法はミオシンに標識したQD(ドナー)とCy3-ATP(アクセプター)間のFRETにより実証する. QDとヌクレオチドポケットの距離を可能な限り短縮するため, QDの粒子径とミオシンへの標識方法を検討した. まず12アミノ酸からなる短鎖ペプチドで表面処理したペプチドコートQDを作成した。短鎖ペプチドは, QDに配位結合するポリシステインと親水性アミノ酸からなり、結果として粒子径の小さな親水性QDが得られる. 次に、ミオシンVの270番目のリジンをシステインに置換した変異体(K270C)を作成した。K270Cのシステイン残基のチオール基とコートペプチドのアミノ末端を架橋することで、ペプチドコートQDとミオシンVの特異的近接結合を実現した。作成したQDミオシンVをカバーガラスに固定し、Cy3-ATPの加水分解を高濃度1分子イメージングしたところ, Cy3とQDの蛍光強度は逆相関を示し、ヌクレオチドの結合解離をFRETのクライテリアで検出できた。ヌクレオチドの解離速度は, ミオシンVのMg ATPase rate(0.02〜0.03 S-1)に一致した. また, 試行錯誤の過程でCaATPase(0.07s^<-1>)がMg ATPaseの約3倍速いことが明らかになったため, Ca存在下での高濃度1分子イメージングを行ったところ, 期待通りの速い解離速度が検出できた.

尽管可以通过总反射荧光显微镜观察一个分子，但是观察到的荧光分子的浓度限制为约50 nm。申请人的建议“一种将量子点（以下称QD）和荧光共振能量传递（以下称重）相结合的单分子成像技术，可以将观察到的荧光分子的浓度增加到200倍的传统方法。该方法由肌蛋白固定QD（Donor）和cy3-atep（donor）和cy3-Atep（quse）（Qy3-Atep）（Q.D-Atep）（Qy3-Atep）进行了qudect（Q.D）。我们尽可能地研究了QD的粒径，并用肌球蛋白标记的方法是用12个氨基酸组成的短链肽质量QD （K270C）创建了在肌球蛋白V的270位，通过与CAC270C的半胱氨酸残留物的交联和大衣肽的氨基末端的交联，并用肽蛋白毒素的特定近端结合在肽蛋白QD和肌球蛋白V之间取代。创建的QD肌球蛋白V固定在盖玻片上，并以高浓度的一个分子成像Cy3-ATP的水解。 CY3和QD的荧光强度显示出反相关性，并且可以通过FRET标准检测到核苷酸结合解离。核苷酸的解离速率与肌球蛋白V的Mg ATPase速率（0.02-0.03 s-1）一致。此外，据表明，在试验和错误期间，当高浓度的单个分解率是在cap的情况下，随着ca的表现，CAATPase（0.07S^<-1>）比MG ATPase快于MG ATPase的速度快三倍。