人工代謝系を用いたキネティクソーム解析技術の開発と大腸菌中心炭素代謝系への応用

人工代谢系统动力学分析技术的开发及其在大肠杆菌中央碳代谢系统中的应用

• 批准号: 20500274
• 负责人: 石井 伸佳
• 金额: $ 1.33万
• 依托单位: Keio University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
• 财政年份: 2008
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2008 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-20500274/
• 关键词: 酵素; 酵素反応速度論; 無細胞タンパク質合成系; 大腸菌

大腸菌エネルギー代謝系の幾つかの酵素(Glk,Pgi)について、無細胞合成系で得られたものと、大腸菌細胞内で大量発現させたもので、基質濃度に対する反応速度論的パラメータ(ミカエリス・メンテン定数)がほぼ同じであることを確認した。したがって、無細胞合成系によって得られた純度の高い酵素を用いた酵素反応速度論的解析が基本的に可能であることが明らかとなった。これにより、生細胞から酵素を抽出する際に一部の酵素で問題となる他酵素のコンタミの問題を回避し、効率的に検討が進められることが示された。多量体を形成する酵素(例:PfkA)については、分子量が大きくなるため、無細胞合成用のキット(PURESYSTEM)に記載の標準のプロトコールでは精製できないことがわかった。この場合、リボソーム除去のステップにおいて、通常のフィルタ(分子量10万Da除去)よりもポアサイズの大きいフィルタを用いる必要があった。多量体を形成する酵素は少なくないため、本知見は、無細胞合成系を用いたサンプル取得におけるノウハウとして有用である。無細胞合成品の比活性については、大腸菌細胞内で大量発現させたものよりかなり低い場合が多かった。ウシ血清アルブミン(BSA)を活性測定時に添加することで、ある程度、活性の低下が防げる場合もあったが、それでも大腸菌細胞内で発現させたものには及ばなかった。無細胞合成時に分子シャペロン(DnaK+DnaJ+GroEまたはGroEL+GroES)を添加することも試みたが効果は無かった。酵素反応速度論的解析に無細胞合成品を利用するためには、比活性を向上する汎用的な手法を開発することが今後の課題である。

大肠杆菌能量代谢酶（GLK，PGI）是在无细胞合成中获得的，并且在阶段细胞中大量。因此，发现基本上有可能使用通过无细胞合成获得的高纯度酶进行酶反应速度理论分析。结果，结果表明，从体内提取酶时，可以将其他酶的问题（某些酶的问题）有效地视为有效。形成大量物体的酶（例如，PFKA），因为分子量很大，因此无法纯化根据纯系统试剂盒（纯净系统）的标准方案。在这种情况下，在核糖体去除步骤中，使用孔径较大的过滤器比正常过滤器（分子量100,000 DA去除）。由于没有很多酶形成大量的酶，因此这种知识很有用，因此使用无细胞的合成系统在样本采集中如何有用。无细胞合成的比例活性通常比在大胆汁细胞中表达的合成低得多。通过在活动测量时添加船员白蛋白（BSA），它可以防止活性在某种程度上减少，但在结肠菌群细胞中仍未表达。在无细胞合成时，我试图添加分子cheperon（dnak+dnaj+groe或groe+groes），但没有影响。为了使用无细胞的合成产品进行酶反应速度理论分析，未来的问题是开发一种通用 - 可使用方法，以改善比例特性。