スプリットルシフェラーゼ系を用いたプレセニリン1の基質選択性に関わる因子の探索

使用分裂荧光素酶系统搜索与早老素 1 底物选择性相关的因素

• 批准号: 08J11338
• 负责人: 佐藤 千尋
• 金额: $ 1.02万
• 依托单位: The University of Tokyo
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for JSPS Fellows
• 财政年份: 2008
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2008 至 2010
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-08J11338/
• 关键词: アルツハマー病; プレセニリン; スクリーニング; Notch; APP; アルツハイマー病; プレセニリン1

γセクレターゼは、AD発症に深く関与するアミロイドβの前駆体APPの膜内配列を切断する酵素であり、アルツハイマー病(AD)の治療標的として注目されている。しかし、γセクレターゼは同時に発生、分化、幹細胞の維持に必須なNotch受容体の切断も担うため、副作用の少ないAD治療薬の開発には、Notchシグナル伝達に影響を与えず、APPの切断を特異的に阻害するγセクレターゼ阻害法の探索が必要である。昨年度申請者は、γセクレターゼの基質特異性を制御する因子のスクリーニングに向けて、まずAPP、Notch各基質とγセクレターゼの蛋白質間相互作用を検出するためのスプリットルシフェラーゼ系を立ち上げた。しかし本系では膜蛋白質間での非特異的な相互作用を起因とする高いノイズが検出され、スクリーニングに十分な検出感度が得られなかった。よって本年度は戦略を修正し、APPの細胞内領域をNotchに置換したキメラ蛋白質を作製し、これとNotchのそれぞれにスプリットルシフェラーゼを融合した。またもう片方のスプリットルシフェラーゼをNotch細胞内領域の核内結合蛋白質Rbpjに融合した。Notchはγセクレターゼによって切断された後、細胞内領域が核内に移動してRbpjと相互作用することが知られている。これによって、APPとNotchの切断をそれぞれ可溶性蛋白質であるNotch細胞内領域とRbpjの相互作用によって評価できる。現在、十分な検出感度を得るために系を改良中。

γ-分泌酶是一种切割β淀粉样蛋白前体APP膜内序列的酶，与AD的发病密切相关，作为阿尔茨海默病(AD)的治疗靶点而受到关注。然而，由于γ-分泌酶还负责裂解Notch受体，而Notch受体对于干细胞的发育、分化和维持至关重要，因此有必要在不影响Notch信号转导的情况下特异性裂解APP，以开发副作用较少的AD疗法。有必要寻找抑制γ-分泌酶的方法。去年，申请人首次建立了裂解荧光素酶系统，检测APP和Notch底物与γ-分泌酶之间的蛋白质-蛋白质相互作用，以筛选控制γ-分泌酶底物特异性的因素。然而，该系统由于膜蛋白之间的非特异性相互作用而检测到高噪音，并且无法获得足以用于筛选的检测灵敏度。因此，今年我们修改了策略，创建了一种嵌合蛋白，其中APP的胞内区域被Notch取代，并将分裂的荧光素酶融合到每个Notch上。此外，另一个裂解荧光素酶与Notch胞内区域的核结合蛋白Rbpj融合。已知Notch被γ-分泌酶裂解后，细胞内区域移动到细胞核中并与Rbpj相互作用。这允许分别通过可溶性蛋白Notch胞内区域和Rbpj之间的相互作用来评估APP和Notch的切割。目前，该系统正在改进以获得足够的检测灵敏度。