人工糖認識ドメインを利用した糖転移酵素の機能解明

使用人工糖识别域对糖基转移酶进行功能阐明

基本信息

批准号：
08J04736
负责人：
吉村弥生
金额：
$ 0.77万
依托单位：
Hokkaido University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for JSPS Fellows
财政年份：
2008
资助国家：
日本
起止时间：
2008 至 2009
项目状态：
已结题

项目摘要

ムチン型糖鎖の還元末端に位置するα-GalNAc構造は、糖転移酵素の1種であるppGalNAcTs(pol-ypeptide N-α-acetylgalactosaminyltransferases)により導入が行われる。ppGalNAcTsは、他の糖転移酵素と異なり触媒ドメインのほかに糖認識能を有するレクチンドメインを有している。このレクチンドメインの機能は未だ未解明な部分も多いが、基質糖ペプチド中の糖の認識に関与していることがこれまでの研究により示唆されている。本研究では、新たなppGalNAcTsの基質特異性解明法として基質糖ペプチド中の糖構造に変化を持たせ、糖転移活性に与える影響を検証することとした。最初に、本研究室で開発されたマイクロ波照射下のFmoc固相合成法によりそれぞれ異なった種類の糖で修飾された糖ペプチドライブラリーの作製を行った。続いて、作製した糖ペプチドに対し3種類のppGalNAc-Tアイソサイムを用いてGalNAc転移反応を行った。すると、アイソサイムにより基質糖ペプチドに対する活性の違いが確認された。一部のppGalNAcTアイソサイムに関してレクチンドメインを除去した変異体を作製し、レクチンドメインが関与している反応の詳細について確認した。GalNAc分子以外の糖が導入された基質糖ペプチドに対してppGalNAcT転移活性を確認した前例はない。本研究より、レクチンドメインが基質中の糖の種類および結合様式を正確に認識していることが証明された。また、本研究手法を応用し、糖をグリコシダーゼで選択的に除去可能な保護基として利用した新規ムチン型糖ペプチドの化学酵素合成法へと発展させた。

位于粘蛋白型糖链还原端的α-GalNAc结构是由ppGalNAcTs（多肽N-α-乙酰半乳糖胺基转移酶）引入的，ppGalNAcTs是一种糖基转移酶。与其他糖基转移酶不同，ppGalNAcTs 除了催化结构域外，还具有具有糖识别能力的凝集素结构域。尽管该凝集素结构域的大部分功能仍然未知，但先前的研究表明它参与底物糖肽中糖的识别。在本研究中，作为阐明 ppGalNAcT 底物特异性的新方法，我们决定改变底物糖肽中的糖结构并检查其对转糖基活性的影响。首先，我们使用我们实验室开发的微波辐射下的Fmoc固相合成方法创建了用不同类型的糖修饰的糖肽库。接下来，使用三种类型的ppGalNAc-T异构体对制备的糖肽进行GalNAc转移反应。结果，确认了对底物糖肽的活性根据同构体的不同而存在差异。我们创建了一些 ppGalNAcT 同构体去除凝集素结构域的突变体，并确认了涉及凝集素结构域的反应细节。对于导入了GalNAc分子以外的糖的底物糖肽，还没有确认ppGalNAcT转移活性的先例。这项研究表明，凝集素结构域能够准确识别底物中糖的类型和结合模式。此外，通过应用这种研究方法，我们开发了一种新型粘蛋白型糖肽的化学酶合成方法，该方法利用糖作为保护基团，可以用糖苷酶选择性去除。