細胞表層提示技術を用いたコリネ菌によるバイオナイロン生産プロセスの開発

利用细胞表面显示技术开发棒状杆菌生物尼龙生产工艺

基本信息

批准号：
08J00859
负责人：
舘野俊博
金额：
$ 0.38万
依托单位：
Kobe University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for JSPS Fellows
财政年份：
2008
资助国家：
日本
起止时间：
2008 至 2009
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-08J00859/
关键词：
Corynebacterium glutamicum Porin

项目摘要

本研究では、バイオリファイナリー実現に向け、Corynebacterium glutamicum(コリネ菌)における細胞表層提示技術の開発及びそれを用いたバイオナイロン生産プロセスの開発を行った。まず、コリネ菌が有する細胞表層に局在するタンパク質をアンカータンパク質とした、コリネ菌における新規細胞表層提示技術の開発を行った。細胞壁に局在する種々のPorin(PorB,PorC,PorH)をアンカータンパク質として用い、Streptococcus bovis 148株由来のα-アミラーゼ(AmyA)をPorinのC末端に融合させ、免疫抗体染色によるAmyA表層発現の確認を行った。その結果、AmyAの細胞表層への局在が確認された。また、Porinを用いてAmyAを細胞表層に提示した菌体を培養し、その培養上清及び菌体を用いてそれぞれのAmyA活性の測定を行った。その結果、AmyA活性は上清からは検出されず、菌体からのみAmyA活性が検出された。これらのことから、PorB,PorC,PorHをアンカータンパク質として用いることで、目的タンパク質を強固に細胞表層に固定化することが可能なコリネ菌における新規細胞表層提示技術の開発に成功した。この技術は、セルラーゼといったセルロース糖化酵素の固定化など、コリネ菌を用いたバイオ変換プロセスにおいて非常に有用なツールとして期待される。次に、コリネ菌を用いたナイロンの原料として利用可能なγ-アミノ酪酸(GABA)の生産を目指した。Lactobacillus brevis IFO12005からグルタミン酸をGABAに変換するグルタミン酸脱炭酸酵素(GadB)のクローニングを行った。今後、このgadB遺伝子をグルタミン酸発酵菌であるコリネ菌に導入することで効率的なGABA生産が期待される。

在这项研究中，开发了细胞表面层的细胞表面层的发展（椎体细菌），并开发了使用它的Bionillon生产过程的发展。首先，在大肠菌细菌中开发了新的细胞表面表现技术，这些技术将位于脂质细菌细胞表面层的蛋白质作为锚固蛋白。使用位于细胞壁上的各种Porin（Porb，Porc，Porh）作为锚蛋白，源自Bovis链球菌148股份的α-淀粉酶（AMYA）与Porin的C末端结合了AMYA的AMYA表面表达 - 通过免疫染色。结果，确认了细胞表面层上AMYA的局部区域。此外，使用孔蛋白培养了带有AMYA向细胞表面层的细菌，并使用培养的上清液和细菌进行AMYA活性。结果，未从上清液中检测到AMYA活性，仅通过细菌检测到细菌。由于这些原因，将PORB，PORC，PORH作为锚蛋白的使用成功地开发了糖化细菌中新的细胞表面层的新细胞表面层，该细胞可以将目的蛋白牢固地固定在细胞表面层上。预计该技术将是使用阳离子细菌（例如纤维素固定）（例如纤维素酶）的BI转化过程中非常有用的工具。接下来，我们的目的是生产γ-氨基盐酸（GABA），该酸可以用作使用雪橇菌的尼龙的原料。进行了谷氨酸（GADB）的克隆，该克隆从Brevis ifo12005转化为GABA，将谷氨酸转化为GABA。将来，通过将这种GADB基因引入发酵谷氨酸的corine细菌中，预计有效的GABA产生。