非小細胞肺癌を標的とするNrf2阻害剤の開発

开发针对非小细胞肺癌的Nrf2抑制剂

• 批准号: 25860634
• 负责人: 光石 陽一郎
• 金额: $ 2.66万
• 依托单位: Tohoku University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Young Scientists (B)
• 财政年份: 2013
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2013-04-01 至 2015-03-31
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-25860634/
• 关键词: 非小細胞肺癌; Nrf2; 創薬スクリーニング; Keap1

Nrf2阻害剤のスクリーニング系の確立するために、Nrf2の抑制因子であるKeap1欠損マウス線維芽細胞(Keap1 KO MEF)を用いた検出系を構築しようと試みた。Keap1欠損によりNrf2 が蓄積する状態を非小細胞肺癌におけるNrf2の過剰蓄積のモデル系と見立てて、Keap1 KO MEFにおけるNrf2機能抑制効果を検出する。既にNrf2の主要標的遺伝子の1つであるヘムオキシゲナーゼ(HO-1)遺伝子座にGFPをノックインしたマウス(HO-1EGFP/+マウス)を用いて、HO-1EGFP/+マウスとKeap1 KOマウスとの交配により、Keap1-/-::HO-1EGFP/+マウスを得てそのMEFを樹立した。同細胞においては、恒常的に安定化したNrf2によりHO-1遺伝子座のEGFPが恒常的に発現する。しかしNrf2のsiRNAを導入した際のEGFP蛍光強度の減少がはっきりと確認できなかった。この原因として、Keap1 KO MEFには既にNrf2が過剰に蓄積しており、EGFPの蛍光強度が強すぎて、一過性のsiRNA導入ではEGFPが分解できなかった可能性がある。このスクリーニング系では、ハイスループットスクリーニングに利用することは困難と考えられた。現在、Keap1 KO MEFを用いて、アデノシン三リン酸(ATP)量をホタル・ルシフェラーゼ発光法で測ることで生細胞数をモニターすることで、直接ハイスループットスクリーニングに使用できるか検討を始めた段階である。

为了建立Nrf2抑制剂的筛选系统，我们尝试使用缺乏Nrf2抑制剂Keap1的小鼠成纤维细胞（Keap1 KO MEF）构建检测系统。利用Keap1缺陷导致Nrf2积累的状态作为非小细胞肺癌中Nrf2过度积累的模型系统，我们将检测Keap1 KO MEF中抑制Nrf2功能的效果。使用已在血红素加氧酶 (HO-1) 基因位点（Nrf2 的主要靶基因之一）敲入 GFP 的小鼠（HO-1EGFP/+ 小鼠），我们将 HO-1EGFP/+ 小鼠与通过交配获得Keap1-/-::HO-1EGFP/+小鼠并建立其MEF。在这些细胞中，由于 Nrf2 的组成型稳定，HO-1 基因座上的 EGFP 持续表达。然而，当引入Nrf2 siRNA时，无法清楚地证实EGFP荧光强度的降低。其原因可能是Nrf2在Keap1 KO MEF中已经过度积累，并且EGFP的荧光强度太强，使得EGFP不能被瞬时siRNA降解。人们认为很难使用该筛选系统进行高通量筛选。我们目前正处于考虑Keap1 KO MEF是否可以直接用于高通量筛选的阶段，通过使用萤火虫荧光素酶发光法测量三磷酸腺苷（ATP）的量来监测活细胞的数量。

项目成果

Annual Review 呼吸器 2014

2014 年呼吸科年度回顾

• 发表时间: 2014
• 作者: 永井厚志;光石陽一郎
• 通讯作者: 光石陽一郎

Annual Review 呼吸器 2015

2015 年呼吸科年度回顾

• 发表时间: 2015
• 作者: 永井厚志;光石陽一郎;本橋ほづみ
• 通讯作者: 本橋ほづみ