自家脂肪幹細胞皮下注入による発毛治療に関する実験的研究

皮下注射自体脂肪干细胞治疗毛发生长的实验研究

• 批准号: 24791918
• 负责人: 沖 正直
• 金额: $ 1.33万
• 依托单位: Dokkyo Medical University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Young Scientists (B)
• 财政年份: 2012
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2012-04-01 至 2013-03-31
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-24791918/
• 关键词: 発毛; 脂肪幹細胞; ヌードマウス

本年の実験では、BALB/cヌードマウスを用いて、脂肪幹細胞を精製し、マウスの背部に皮下注入する実験手技を確立した。当初はマウスの両側鼠径部から脂肪を採取する予定であったが、実際には鼠径部からは少量の脂肪しか採取できないことが判明したため、腹腔内の腸間膜より採取する方針とした。この時点で、ドナーマウスを生存したまま管理することが困難であり、自家脂肪由来の脂肪幹細胞の実験手技確立には更なる工夫を要することが明らかとなったが、まずは、本実験手技の確立を目指すこととし、ドナーマウスは、プロトコルに従って、安楽死させることとした。採取した脂肪を、十分に粉砕・撹拌し、0.1％コラゲナーゼを溶解したリン酸緩衝液を加えて、37℃温浴槽で処理後、ダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）を十分量加えて、酵素を失活させ、遠心分離して培地を除去する。これにより、脂肪幹細胞を含む間質細胞集団が得られる。しかし、この操作により得られる細胞塊は極少量のため、背部に皮下注入するには不十分な量であった。注入量に十分な細胞数として、106～7個の細胞集団と設定し、上記操作で得られた細胞塊に、DMEMを加えてインキュベーター内で数日間培養を行い、間質系細胞の増殖を確認した。十分に細胞が増殖したところで、トリプシンで細胞を剥がし、この溶液を少量採取して顕微鏡下に細胞数をカウントした後、遠心分離を行い、細胞塊を単離。これに、0.1ml中に106の細胞が入る量となるよう、リン酸緩衝液を加えて、注入薬の作成が完了する。この注入薬を、レシピエントマウスの背部皮下に3～4ヶ所、1ヶ所につき0.1mlずつ注入し、同部位の観察を行った。本年度は、計10匹のレシピエントマウスに注入実験を行ったが、本年度中に、注入部位における発毛は観察されなかった。本年中は、上記実験プロトコルの確立、及び、その手技の習得を達成した。

在今年的实验中，建立了一种实验技术，其中使用BALB/C裸小鼠纯化脂肪干细胞，并皮下注入小鼠的背部。最初，计划从小鼠的两个腹股沟区域收集脂肪，但实际上，实际上，只能从腹股沟区域收集少量脂肪，因此计划是从腹腔中的Mesenterus收集它。在这一点上，很明显，在供体小鼠还活着的时候很难管理它们，并且需要进一步的创造力来建立自体脂肪源性脂肪干细胞的实验技术。但是，首先，目的是建立这种实验技术，并根据协议对供体小鼠进行安乐死。收集的脂肪是彻底的地面并搅拌的，磷酸盐缓冲溶液中添加了0.1％的胶原酶，并在37°C进行处理后，热水浴中，添加了足够量的Dulbecco修饰的Eagle的培养基（DMEM），以灭活酶，并以酶离心，以去除培养基。这导致含有脂肪干细胞的基质细胞群。但是，由于通过此过程获得的细胞质量量很小，因此皮下注射不足。将细胞群设置为足够数量的注射量细胞，并将上述过程中获得的细胞质量与DMEM一起添加并在孵化器中培养几天，以确认间质细胞的增殖。一旦细胞生长得充分，将细胞用胰蛋白酶剥离，收集少量该溶液，并在显微镜下计数细胞的数量，然后离心以分离细胞质量。为此，将磷酸盐缓冲液添加到0.1 mL中的106个细胞中，以完成注射药物的制备。在每个位置的3-4个位置，3-4个位置将这种输注注入0.1 mL的位置，并观察到同一区域。今年对总共10只受体小鼠进行了注射实验，但今年注射部位未观察到头发生长。在今年，建立了上述实验方案并获得了技术的获取。