Ｓｏｘ９を活性化する薬剤を用いた軟骨欠損・変性疾患に対する治療法の開発

使用激活 Sox9 的药物开发软骨缺陷和退行性疾病的治疗方法

基本信息

批准号：
24592259
负责人：
金子浩史
金额：
$ 3.41万
依托单位：
Nagoya University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
财政年份：
2012
资助国家：
日本
起止时间：
2012-04-01 至 2014-03-31
项目状态：
已结题

项目摘要

SOX9は軟骨基質の形質維持に極めて重要であり、SOX9の発現を促進することにより軟骨変性の防止あるいは変性軟骨の修復が期待できる。マウス軟骨前駆細胞株ATDC5にSOX9プロモーター領域を挿入したベクターをトランスフェクションし定常発現株を作成した。ATDC5はインスリン添加により未分化間葉系細胞から軟骨細胞へ分化することが知られている。作成した定常発現株も通常のATDC5と同様にインスリン添加により軟骨多段階分化モデルが作成できることを確認した。SOX9を活性化する薬剤を同定する目的で1200種類のスクリーニング用薬剤（Prestwick Chemical社）を用いたルシフェラーゼアッセイによる薬効1次スクリーニングを行い候補薬剤を48種類に絞り、2次にて16薬剤、さらに3次にて濃度依存性を認めた4薬剤に絞った。4次スクリーニングとして、正常ATDC5に4薬剤を添加し、定量的RT-PCR 法によりSOX9およびその下流に位置するII型コラーゲンおよびアグリカンのmRNA 発現を検討した。また、軟骨のプロテオグリカンを評価するためアルシアンブルー染色を行い、吸光度測定により定量化した。その結果、抗アレルギー剤Xがコントロール（ジメチルスルホキシドのみ添加）と比較して10～100μMの範囲で濃度依存性にSOX9、II型コラーゲンおよびアグリカンのmRNAを上昇させ、さらにプロテオグリカン含有量を増加させていた。

SOX9对于维持软骨基质的性质极其重要，促进SOX9的表达有望预防软骨退化或修复退化软骨。通过用含有 SOX9 启动子区域的载体转染小鼠软骨祖细胞系 ATDC5 来创建恒定表达细胞系。已知 ATDC5 在添加胰岛素后可从未分化的间充质细胞分化为软骨细胞。证实所建立的恒定表达菌株也可用于通过添加胰岛素来建立软骨多步分化模型，类似于正常ATDC5。为了鉴定激活SOX9的药物，我们使用1,200种筛选药物（Prestwick Chemical）通过荧光素酶测定法进行了第一次药效筛选，将候选药物缩小到48种，在第二次筛选中我们将候选药物缩小到在第三阶段，我们将研究范围缩小到 16 种药物，发现这些药物具有浓度依赖性。作为第四次筛选，在正常ATDC5中添加四种药物，并通过定量RT-PCR检测SOX9及其下游II型胶原和聚集蛋白聚糖的mRNA表达。另外，为了评价软骨蛋白多糖，进行阿新蓝染色，并通过吸光度测定进行定量。结果，抗过敏剂Ta。