対象配列特異的シークエンシング法によるドラフトゲノムの効率的精度向上法の確立

建立利用目标序列特异性测序提高基因组草图准确性的有效方法

基本信息

批准号：
24570011
负责人：
清水厚志
金额：
$ 3.58万
依托单位：
Keio University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
财政年份：
2012
资助国家：
日本
起止时间：
2012-04-01 至 2013-03-31
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-24570011/
关键词：
次世代シークエンサーゲノム解析ドラフトゲノム Fosmid

项目摘要

次世代シークエンサーの台頭により、ゲノム配列が解読された生物種が急激に増加している。しかし、ヒト、マウスを除き、公開された概要（ドラフト）配列の精度は70%から90%にとどまり、モデル生物として確立されたラットやメダカ、ゼブラフィッシュなどのゲノム精度は利用している研究者のニーズを十分には満たしていない。そこで本研究計画ではメダカゲノムを解析対象に選定し、ドラフトゲノム配列の精度を向上させる手法を検討した。平均冗長度x11のFosmidライブラリー末端配列データベースから５個のテロメア配列を含むクローンと３つのコントロールクローンを選定し、MiSeqのマルチプレックス法にて配列決定を行った。複数のソフトウェアでテロメアを含まないクローンのde novo アセンブルを行った結果、CLC Genomics WorkbenchとSOAPdenovoで完成配列を得ることができた。しかし、テロメア周辺のクローンには相同性の極めて高い（>99%）Low Copy Repeat（LCR）が存在したため、MiSeqのデータのみでは完成配列を得ることができなかった。そこで、平均2kb以上の長鎖DNA配列を得ることができるシークエンサーであるPacBio RSにより、配列決定を行い、先のデータと混合アセンブルをした結果、99%以上の相同性をもつLCRを正しく分離することが可能になり、完全長配列を得ることができた。以上の結果から混合アセンブルにより、複雑なゲノム構造をもつテロメア周辺クローンの配列決定が可能であると判断した。そこで、データベースからテロメア配列を含む240個のクローンの末端配列を抽出し、ユニークな配列をもつ12クローンを選抜してMiSeqとPacBio RSでシークエンシングを行った。現在、それぞれのクローンごとに配列解析中である。

随着下一代测序仪的兴起，基因组已被测序的生物物种数量正在迅速增加。然而，除了人类和小鼠之外，已发表的概要（草案）序列的准确性仅为 70% 至 90%，研究人员正在使用已被确立为模型生物的大鼠、青鳉和斑马鱼的基因组准确性，并不能完全满足需求因此，在本研究项目中，我们选择青鳉基因组作为分析目标，并研究提高基因组草图序列准确性的方法。从Fosmid文库末端序列数据库中筛选出含有5个端粒序列的克隆和3个对照克隆，平均冗余度为x11，并使用MiSeq的多重方法进行测序。由于使用多个软件对无端粒克隆进行从头组装，我们能够使用 CLC Genomics Workbench 和 SOAPdenovo 获得完整的序列。然而，由于端粒周围的克隆含有同源性极高（>99%）的低拷贝重复序列（LCR），因此仅使用 MiSeq 数据不可能获得完整的序列。因此，我们使用PacBio RS（一种平均可以获得2 kb或更长的DNA序列的测序仪）进行测序，并将数据与之前的数据混合并组装，结果我们能够以99%的正确率分离LCR。或更同源性，这使得获得全长序列成为可能。基于上述结果，我们得出结论，通过混合组装对具有复杂基因组结构的端粒外周克隆进行测序是可能的。因此，我们从数据库中提取了240个含有端粒序列的克隆的末端序列，选择了12个具有独特序列的克隆，并使用MiSeq和PacBio RS对其进行了测序。目前正在对每个克隆进行序列分析。