細胞障害性HCV培養系を用いた重症C型肝炎発症機構の解析

利用细胞毒性HCV培养系统分析重型丙型肝炎的发病机制

• 批准号: 22590720
• 负责人: 筬島 裕子
• 金额: $ 2.83万
• 依托单位: Tokyo Medical and Dental University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
• 财政年份: 2010
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2010-04-01 至 2013-03-31
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-22590720/
• 关键词: HCV-JFH1培養系; プラークアッセイ; 細胞障害効果; RNAポリメラーゼ

今年度本研究では、ウイルス感染価を定量する基本手技であるプラークアッセイ法をHCV-JFH1感染培養系に応用し、細胞障害性プラーク単離の反復を行い、高度細胞障害性ウイルスクローンの単離とその機能解析、およびウイルス遺伝子変異の解析を遂行し以下の結果を得た。(1)HCV-JFH1株をHhu-7.5.1細胞に感染後形成された独立した6カ所のプラークを単離し、個々の上清を再感染させたところ、高レベルの増殖と著明な細胞死が観察された。(2)単離されたクローン(JFH1-P1)の遺伝子解析を行ったところ、9個のアミノ酸変異を認め、そのうち6個がNS5B領域C末端側に集中していた。(3)全長HCV-JFH1プラスミドに、同定された6個の変異を個々あるいは複数個導入したHCV-JFH1サブクローンを作成し、Huh-7.5.1細胞にトランスフェクションしウイルス増殖粒子形成能を解析した。このうち3個の変異を導入した変異クローンで親株JFH1より著明に高レベルの感染増殖能が観察された。以上より、HCVの特定の遺伝子構造がウイルスの感染増殖能を規定していることが示された。細胞障害性クローンの遺伝子解析により同定された9個のアミノ酸のうち6個がRNA依存性RNAポリメラーゼであるNS5B領域に集中していたことから、遺伝子構造の変化がウイルスの増殖能及び細胞障害性に関与していると考えられた。次年度以降は、高度細胞障害性JFH1クローンを用いて増殖感染能や粒子形成能機能解析や、ヒト肝細胞移植Alb-uPA/SCIDマウスを用いin vivoにおけるウイルス感染増殖動態を解析し、劇症肝炎動物モデルの構築を試みる。

在今年的研究中，我们将定量病毒感染性的基本技术——空斑测定方法应用于HCV-JFH1感染的培养系统，进行细胞毒性空斑的重复分离，并分离出高细胞毒性病毒克隆。对病毒基因突变进行分析和分析，得到以下结果。 (1)当我们分离出HCV-JFH1株感染Hhu-7.5.1细胞后形成的六个独立斑块并用单个上清液重新感染它们时，我们发现观察到高水平的增殖和显着的细胞增殖。 (2)对分离的克隆(JFH1-P1)进行遗传分析，发现9个氨基酸突变，其中6个集中在NS5B区域的C端侧。 (3)将已鉴定的6种突变中的一种或多种引入全长HCV-JFH1质粒中，创建HCV-JFH1亚克隆，将其转染至Huh-7.5.1细胞中，并分析形成病毒复制颗粒的能力。其中，在引入三个突变的突变克隆中观察到比亲本菌株JFH1显着更高水平的感染和增殖能力。上述结果表明，HCV的特定基因结构决定了病毒的感染和繁殖能力。通过对细胞毒性克隆进行遗传分析鉴定出的9个氨基酸中，有6个集中在NS5B区域，该区域是一种RNA依赖性RNA聚合酶，表明基因结构的变化影响病毒的增殖能力及其细胞毒性。涉及。从明年起，我们将利用高细胞毒性的JFH1克隆来分析生产性感染和颗粒形成的功能能力，并利用移植人肝细胞的Alb-uPA/SCID小鼠来分析病毒在体内感染和生长的动态。构建肝炎动物模型。

项目成果

Cell Culture and in vivo analyses of cytopathic hepatitis C virus mutanis

细胞病变丙型肝炎病毒变异的细胞培养和体内分析

• 发表时间: 2010
• 期刊: Virology
• 影响因子: 3.7
• 作者: Mishima K;Sakamoto N;Sekine
• 通讯作者: Sekine