ファンコニ貧血経路のリン酸化制御によるゲノム安定性維持機構

范可尼贫血途径磷酸化调节的基因组稳定性维持机制

基本信息

批准号：
10J03724
负责人：
板谷亜希子
金额：
$ 1.79万
依托单位：
Kyoto University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for JSPS Fellows
财政年份：
2010
资助国家：
日本
起止时间：
2010 至 2013-03-31
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-10J03724/
关键词：
DNA損傷応答 Fanconi貧血リン酸化脱リン酸化酵素 DNA修復

项目摘要

我々は、最近ファンコニ貧血遺伝子FANCIが、放射線などによるDNA損傷ないし複製ストレスを受けた細胞においてリン酸化され、モノユビキチン化された後すみやかに脱リン酸化されることを見いだした。FANCIリン酸化はFANCD2のモノユビキチン化の分子スイッチであり、その脱リン酸化は、ファンコニ貧血経路によるDNA損傷チェックポイントとDNA修復を制御する重要なイベントと考えられる。本研究においては、FA経路活性化に関わる脱リン酸化酵素の分子種を同定し、その脱リン酸化の制御がどのように行われているか、明らかにする。もしFANCI脱リン酸化酵素の抑制剤が開発できれば、FANCIをリン酸化誘導しFA患者、家族性乳がん患者においてもFA経路の活性化ができる可能性がある。平成22年度の研究内容として、FANCI脱リン酸化酵素の同定を行った。スクリーニングを行う上で、まず従来DNA損傷応答に関与するとされている4種の脱リン酸化酵素の遺伝子(wip1, PP4c, PP2Acα, PP2Acβ)にてヒト細胞株でsiRNAによるノックダウンを行い、DNA損傷処理後、FANCD2モノユビキチン化に対する効果を検証した。明確にFANCD2モノユビキチン化を増強させる効果は得られず、さらに広範囲な検討が必要と考え30種類を超えるsiRNAによるヒトのセリン/スレオニン脱リン酸化酵素等をカバーしてスクリーニングをおこなった。各脱リン酸化酵素のノックダウンの効果は、FANCD2モノユビキチン化でのウェスタンにより検討した。FANCD2モノユビキチン化を増強させる効果は得られたのは、ILKAPとPSPHであった。面白いことに、PP2Aのcatalytic subunitα型(PP2ACα)のノックダウンにより、FANCD2モノユビキチン化がはっきりと抑制された。さらにPP2Aのregulatory subunitであるとPPP2R5D (PP2A/B56δ)のノックダウンにても同様にFANCD2モノユビキチン化がはっきりと抑制されていた。今後これらの脱リン酸化酵素がいかにFA経路を制御するのか、そのターゲットを同定する必要がある。また、候補のFANCIの脱リン酸化酵素遺伝子(PP4CR3β、Wip1、PP2Cγ)について、ニワトリB細胞株DT40細胞を用いてノックアウト細胞を作製し、表現型を検討した。放射線感受性、マイトマイシンC刺激によるFANCD2モノユビキチン化に対する効果を検証したが、明らかな放射線感受性は認めず、明確にFANCD2モノユビキチン化を増強させる効果は得られなかった。

我们最近发现，在受到DNA损伤或复制应激的细胞中（例如通过辐射），Fanconi贫血基因fanci被磷酸化并去磷酸化，并在被辐射中迅速脱磷酸化。 Fanci磷酸化是一种用于fancd2单泛素化的分子开关，其去磷酸化被认为是一个重要的事件，可通过Fanconi贫血途径调节DNA损伤检查点和DNA修复。在这项研究中，我们将确定与FA途径激活有关的分子脱磷酸化物种，并阐明如何控制其去磷酸化。如果可以开发FANCI去磷酸化的抑制剂，则可能会磷酸化Fanci并激活FA患者和家族性乳腺癌患者的FA途径。作为2010年研究主题的一部分，我们确定了Fanci去磷酸化酶。进行筛选时，使用四种脱磷酸化酶的基因将人类细胞系击倒，这些酶通常参与DNA损伤反应（WIP1，PP4C，PP2ACα，PP2ACβ），以及对DNA损伤治疗后对FANCD2 MONUBITITINATION的影响。目前尚不清楚增强fancd2单泛素化的作用，并且有必要进一步广泛研究结果，并进行筛选以覆盖人类丝氨酸/苏宁去磷酸化酶和其他使用30多种siRNA的物质。通过FANCD2单次夸夸其在，研究了每种去磷酸化酶的敲低的影响。在ILKAP和PSPH中获得了增强FANCD2单泛素化的影响。有趣的是，催化亚基型PP2A（PP2ACα）的敲低清楚地抑制了FANCD2单样泛素化。此外，当PPP2A是一个受调节的亚基时，fancd2单泛素化也明显地被PPP2R5D（PP2A/B56Δ）的敲低抑制。有必要确定这些去磷酸化酶如何调节FA途径的靶标。此外，使用鸡B细胞系DT40细胞为候选Fanci去磷酸化基因（PP4CR3β，WIP1，PP2Cγ）产生基因敲除细胞，并检查了表型。我们研究了辐射敏感性和丝裂霉素C刺激对FANCD2单次素激素的影响，但是没有发现明显的辐射敏感性，并且没有明确获得效果以增强fancd2单次夸夸其二。