ファンコニ貧血経路のリン酸化制御によるゲノム安定性維持機構

范可尼贫血途径磷酸化调节的基因组稳定性维持机制

基本信息

批准号：
10J03724
负责人：
板谷亜希子
金额：
$ 1.79万
依托单位：
Kyoto University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for JSPS Fellows
财政年份：
2010
资助国家：
日本
起止时间：
2010 至 2013-03-31
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-10J03724/
关键词：
DNA損傷応答 Fanconi貧血リン酸化脱リン酸化酵素 DNA修復

项目摘要

我々は、最近ファンコニ貧血遺伝子FANCIが、放射線などによるDNA損傷ないし複製ストレスを受けた細胞においてリン酸化され、モノユビキチン化された後すみやかに脱リン酸化されることを見いだした。FANCIリン酸化はFANCD2のモノユビキチン化の分子スイッチであり、その脱リン酸化は、ファンコニ貧血経路によるDNA損傷チェックポイントとDNA修復を制御する重要なイベントと考えられる。本研究においては、FA経路活性化に関わる脱リン酸化酵素の分子種を同定し、その脱リン酸化の制御がどのように行われているか、明らかにする。もしFANCI脱リン酸化酵素の抑制剤が開発できれば、FANCIをリン酸化誘導しFA患者、家族性乳がん患者においてもFA経路の活性化ができる可能性がある。平成22年度の研究内容として、FANCI脱リン酸化酵素の同定を行った。スクリーニングを行う上で、まず従来DNA損傷応答に関与するとされている4種の脱リン酸化酵素の遺伝子(wip1, PP4c, PP2Acα, PP2Acβ)にてヒト細胞株でsiRNAによるノックダウンを行い、DNA損傷処理後、FANCD2モノユビキチン化に対する効果を検証した。明確にFANCD2モノユビキチン化を増強させる効果は得られず、さらに広範囲な検討が必要と考え30種類を超えるsiRNAによるヒトのセリン/スレオニン脱リン酸化酵素等をカバーしてスクリーニングをおこなった。各脱リン酸化酵素のノックダウンの効果は、FANCD2モノユビキチン化でのウェスタンにより検討した。FANCD2モノユビキチン化を増強させる効果は得られたのは、ILKAPとPSPHであった。面白いことに、PP2Aのcatalytic subunitα型(PP2ACα)のノックダウンにより、FANCD2モノユビキチン化がはっきりと抑制された。さらにPP2Aのregulatory subunitであるとPPP2R5D (PP2A/B56δ)のノックダウンにても同様にFANCD2モノユビキチン化がはっきりと抑制されていた。今後これらの脱リン酸化酵素がいかにFA経路を制御するのか、そのターゲットを同定する必要がある。また、候補のFANCIの脱リン酸化酵素遺伝子(PP4CR3β、Wip1、PP2Cγ)について、ニワトリB細胞株DT40細胞を用いてノックアウト細胞を作製し、表現型を検討した。放射線感受性、マイトマイシンC刺激によるFANCD2モノユビキチン化に対する効果を検証したが、明らかな放射線感受性は認めず、明確にFANCD2モノユビキチン化を増強させる効果は得られなかった。

我们最近发现，范可尼贫血基因 FANCI 在因辐射等原因而遭受 DNA 损伤或复制应激的细胞中被磷酸化，并在单泛素化后迅速去磷酸化。 FANCI磷酸化是FANCD2单泛素化的分子开关，其去磷酸化被认为是通过范可尼贫血途径调节DNA损伤检查点和DNA修复的关键事件。在本研究中，我们将鉴定参与 FA 途径激活的去磷酸化酶的分子种类，并阐明去磷酸化是如何控制的。如果能够开发出FANCI去磷酸化酶的抑制剂，即使在FA患者和家族性乳腺癌患者中，也有可能诱导FANCI磷酸化并激活FA途径。作为 2010 年研究的一部分，我们发现了 FANCI 去磷酸酶。在进行筛选时，我们首先使用 siRNA 在人类细胞系中敲低四种去磷酸化酶（wip1、PP4c、PP2Acα、PP2Acβ）的基因，这些酶通常被认为参与 DNA 损伤反应。 FANCD2 单泛素化得到验证。我们没有发现增强FANCD2单泛素化的明显作用，并认为需要进行更广泛的研究，因此我们使用30多种siRNA进行了筛选，涵盖人类丝氨酸/苏氨酸去磷酸化酶。通过 FANCD2 单泛素化的 Western 分析来检查每种去磷酸化酶的敲低效果。 ILKAP 和 PSPH 可有效增强 FANCD2 单泛素化。有趣的是，PP2A (PP2ACα) 催化亚基 α 形式的敲除明显抑制了 FANCD2 单泛素化。此外，敲低 PP2A 的调节亚基 PPP2R5D (PP2A/B56δ) 也明显抑制 FANCD2 单泛素化。未来，有必要确定这些去磷酸化酶如何控制 FA 途径的靶标。此外，使用鸡B细胞系DT40细胞生成候选FANCI去磷酸化酶基因（PP4CR3β、Wip1、PP2Cγ）的敲除细胞，并检查表型。我们检查了丝裂霉素C刺激诱导的放射敏感性和FANCD2单泛素化的影响，但没有观察到明显的放射敏感性，并且没有获得明显的增强FANCD2单泛素化的作用。