細胞増殖因子HB-EGFの分泌制御機構の解析

细胞生长因子HB-EGF分泌调控机制分析

• 批准号: 19790259
• 负责人: 麻野 四郎
• 金额: $ 2.42万
• 依托单位: Osaka University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Young Scientists (B)
• 财政年份: 2007
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2007 至 2008
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-19790259/
• 关键词: 細胞増殖因子; エクトドメインシェディング; HB-EGF; ADAMプロテアーゼ; 遺伝子スクリーニング; siRNAライブラリー

HB-EGFを含むEGFファミリーの分子は全て膜結合型で産生され、細胞外ドメインがプロテアーゼによって切断されるシェディングという過程を経て初めて分泌型となるが、この過程は個体発生と腫瘍形成に重要な意味を持つことが示されている。EGFファミリーのシェディングの分子機構については、細胞内カルシウム濃度、PKCの活性化、Rasの活性化、ストレス刺激などが重要な役割を果たしていることが知られている。また、ADAM17/TACEプロテアーゼがEGFファミリーの全てのシェディングに関与していることが分かっている。しかし、種々の細胞外刺激に対応した多様なシグナルの活性化がADAM17によるEGFファミリーのシェディングへと収束する分子機構については不明である。この部分の解明を目標としてHB-EGFのシェディングに至るシグナル経路をsiRNAライブラリーを用いたスクリーニングにより明らかにすることが本研究の目的である。申請者らはsiRNAライブラリーを用いて、HB-EGFシェディングに関与する分子のスクリーニングをする系を確立し、分子の同定を終了しつつある。スクリーニングの概要を以下に述べる。まず、HB-EGFをヒト子宮内膜癌由来HECI細胞に高発現したHECI-H細胞にSBI社のsiRNAレンチウイルスライブラリーを感染させ、様々な遺伝子の機能を欠損した細胞群を構築する。そして、HB-EGFのシェディングを誘導するために、HECI-H細胞にTPA刺激を与える。刺激後、トリプシン処理でHECI-H細胞を浮遊化し、HB-EGFに対する抗体を用いて細胞膜上のHB-EGFを染色する。シェディングが起こっていない細胞は細胞表面にHB-EGFの細胞外ドメインが残存しており、強いシグナルを出すと考えられる。HB-EGFシェディング能を欠いていると思われるこれらの細胞をセルソーターFACSAriaを用いて分取する。分取された細胞からRNAを回収し、siRNA周辺の塩基配列特異的なプライマーを用いて、siRNA配列を含むDNAを増幅する。SBI社のsiRNAライブラリーのsiRNAの配列はアフィメトリックス社のマイクロアレイに対応している。このため、マイクロアレイ解析により分取された細胞群で発現されていたsiRNAが容易に同定できた。また、これらのsiRNA発現ベクターをクローン化し、実際にHB-EGFのエクトドメインシェディングを阻害することも確認できた。さらに、これらのsiRNAがターゲットとする遺伝子に対する別のsiRNA発現ベクターを作製し、このsiRNAもエクトドメインシェディングを阻害することも確認し、HB-EGFのエクトドメインシェディングに関与する新規の遺伝子が同定できた。今後は、この遺伝子がADAM17/TACEプロテアーゼを活性化する分子機構の解明に向けて研究を進めていく予定である。

所有EGF家族分子（包括HB-EGF）均以膜结合形式产生，并且仅在进行脱落过程后才被分泌，其中细胞外域被蛋白酶裂解，但已证明该过程对发作和肿瘤形成具有重要意义。关于EGF家族中脱落的分子机制，众所周知，细胞内钙浓度，PKC的激活，RAS的激活和应力刺激起着重要作用。还发现ADAM17/TACE蛋白酶参与EGF家族的所有脱落。然而，尚不清楚，通过ADAM17将各种信号激活各种信号响应各种信号响应EGF家族的分子机制尚不清楚。这项研究的目的是阐明通过使用siRNA库筛选HB-EGF脱落的信号途径。申请人正在使用siRNA文库来建立一个用于筛选HB-EGF脱落的分子的系统，并开始终止其分子的鉴定。下面给出了筛选的摘要。首先，在人子宫内膜癌衍生的HECI细胞中高度表达的HECI-H细胞感染了SBI的siRNA慢病毒库，并且构建了各种基因功能不足的细胞。然后，通过TPA刺激HECI-H细胞诱导HB-EGF脱落。刺激后，HECI-H细胞被胰蛋白酶悬浮，并用抗Hb-EGF抗体在细胞膜上染色HB-EGF。尚未脱落的细胞具有保留在细胞表面的HB-EGF的细胞外结构域，并被认为会散发出强信号。这些似乎缺乏HB-EGF脱落能力的细胞是使用细胞分隔器Facsaria分离的。从分离的细胞中收集RNA，并使用特定于siRNA序列的引物扩增含有siRNA序列的DNA。 SBI的siRNA库中的siRNA序列对应于Adpimetrics的微阵列。因此，很容易鉴定通过微阵列分析收集的细胞组表达的siRNA。也证实了这些siRNA表达载体被克隆，实际上抑制了HB-EGF的外生域脱落。此外，我们为这些siRNA的靶基因创建了另一个siRNA表达载体，并确认该siRNA也抑制了外生域的脱落，并且我们能够鉴定出与HB-EGF脱落的新型基因。将来，我们计划继续研究，以阐明该基因激活ADAM17/TACE蛋白酶的分子机制。