細胞増殖因子HB-EGFの分泌制御機構の解析

细胞生长因子HB-EGF分泌调控机制分析

• 批准号: 19790259
• 负责人: 麻野 四郎
• 金额: $ 2.42万
• 依托单位: Osaka University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Young Scientists (B)
• 财政年份: 2007
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2007 至 2008
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-19790259/
• 关键词: 細胞増殖因子; エクトドメインシェディング; HB-EGF; ADAMプロテアーゼ; 遺伝子スクリーニング; siRNAライブラリー

HB-EGFを含むEGFファミリーの分子は全て膜結合型で産生され、細胞外ドメインがプロテアーゼによって切断されるシェディングという過程を経て初めて分泌型となるが、この過程は個体発生と腫瘍形成に重要な意味を持つことが示されている。EGFファミリーのシェディングの分子機構については、細胞内カルシウム濃度、PKCの活性化、Rasの活性化、ストレス刺激などが重要な役割を果たしていることが知られている。また、ADAM17/TACEプロテアーゼがEGFファミリーの全てのシェディングに関与していることが分かっている。しかし、種々の細胞外刺激に対応した多様なシグナルの活性化がADAM17によるEGFファミリーのシェディングへと収束する分子機構については不明である。この部分の解明を目標としてHB-EGFのシェディングに至るシグナル経路をsiRNAライブラリーを用いたスクリーニングにより明らかにすることが本研究の目的である。申請者らはsiRNAライブラリーを用いて、HB-EGFシェディングに関与する分子のスクリーニングをする系を確立し、分子の同定を終了しつつある。スクリーニングの概要を以下に述べる。まず、HB-EGFをヒト子宮内膜癌由来HECI細胞に高発現したHECI-H細胞にSBI社のsiRNAレンチウイルスライブラリーを感染させ、様々な遺伝子の機能を欠損した細胞群を構築する。そして、HB-EGFのシェディングを誘導するために、HECI-H細胞にTPA刺激を与える。刺激後、トリプシン処理でHECI-H細胞を浮遊化し、HB-EGFに対する抗体を用いて細胞膜上のHB-EGFを染色する。シェディングが起こっていない細胞は細胞表面にHB-EGFの細胞外ドメインが残存しており、強いシグナルを出すと考えられる。HB-EGFシェディング能を欠いていると思われるこれらの細胞をセルソーターFACSAriaを用いて分取する。分取された細胞からRNAを回収し、siRNA周辺の塩基配列特異的なプライマーを用いて、siRNA配列を含むDNAを増幅する。SBI社のsiRNAライブラリーのsiRNAの配列はアフィメトリックス社のマイクロアレイに対応している。このため、マイクロアレイ解析により分取された細胞群で発現されていたsiRNAが容易に同定できた。また、これらのsiRNA発現ベクターをクローン化し、実際にHB-EGFのエクトドメインシェディングを阻害することも確認できた。さらに、これらのsiRNAがターゲットとする遺伝子に対する別のsiRNA発現ベクターを作製し、このsiRNAもエクトドメインシェディングを阻害することも確認し、HB-EGFのエクトドメインシェディングに関与する新規の遺伝子が同定できた。今後は、この遺伝子がADAM17/TACEプロテアーゼを活性化する分子機構の解明に向けて研究を進めていく予定である。

EGF家族的所有分子，包括HB-EGF，均以膜结合形式产生，并且仅通过称为脱落的过程分泌，其中细胞外结构域被蛋白酶切割，该过程对于个体发育和肿瘤发生很重要已被证明具有重大意义。关于EGF家族脱落的分子机制，已知细胞内钙浓度、PKC激活、Ras激活、应激刺激等发挥重要作用。此外，已知 ADAM17/TACE 蛋白酶参与 EGF 家族的所有脱落。然而，ADAM17 响应各种细胞外刺激而激活各种信号并导致 EGF 家族脱落的分子机制尚不清楚。本研究的目的是通过使用 siRNA 文库进行筛选，阐明导致 HB-EGF 脱落的信号通路，从而阐明这一部分。申请人已经建立了利用siRNA文库筛选参与HB-EGF脱落的分子的系统，并且正在完成分子的鉴定。筛选的概述如下所述。首先，将人子宫内膜癌来源的HECI细胞中HB-EGF高表达的HECI-H细胞用SBI的siRNA慢病毒文库感染，构建缺乏各种基因功能的细胞群。然后，对 HECI-H 细胞施加 TPA 刺激以诱导 HB-EGF 脱落。刺激后，HECI-H细胞通过胰蛋白酶处理悬浮，并使用针对HB-EGF的抗体对细胞膜上的HB-EGF进行染色。在未发生脱落的细胞中，HB-EGF 的胞外结构域保留在细胞表面，并被认为会发出强烈的信号。使用细胞分选仪 FACSAria 对这些似乎缺乏 HB-EGF 脱落能力的细胞进行分选。从分选的细胞中收集RNA，并使用对siRNA周围的碱基序列特异的引物扩增含有siRNA序列的DNA。 SBI 的 siRNA 文库的 siRNA 序列与 Affymetrix 的微阵列相对应。因此，通过微阵列分析分选的细胞群中表达的siRNA可以很容易地被识别。我们还克隆了这些 siRNA 表达载体，并证实它们确实抑制了 HB-EGF 的胞外域脱落。此外，我们为这些 siRNA 靶向的基因创建了另一种 siRNA 表达载体，并证实该 siRNA 也抑制胞外域脱落，这表明我能够识别出参与 HB-EGF 胞外域脱落的新基因。未来，我们计划开展研究，阐明该基因激活ADAM17/TACE蛋白酶的分子机制。