新規タンパク質shootin1を中心とした軸索伸長を司る基本メカニズムの解析

以新型蛋白shootin1为中心分析控制轴突生长的基本机制

基本信息

批准号：
19700291
负责人：
島田忠之
金额：
$ 2.38万
依托单位：
Nara Institute of Science and Technology
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Young Scientists (B)
财政年份：
2007
资助国家：
日本
起止时间：
2007 至 2008
项目状态：
已结题

项目摘要

Shootin1のリン酸化修飾により、shootin1とL1-CAM、shootin1とアクチン繊維の相互作用がどのように制御されているかを解析する。shootin1とL1-CAM、shootin1とアクチン繊維との相互作用を制御するメカニズムを、shootin1のリン酸化修飾に焦点を絞り解析した。shootin1がリン酸化修飾を受けるアミノ酸残基を、質量分析を用いて明らかにするため、第一に、HEK293T培養細胞にmycタグを付加したshootin1を発現させ、細胞を脱リン酸化酵素の阻害剤であるフォルスコリンで処理し細胞培養液を、抗myc抗体を用いて免疫沈降し、リン酸化されたshootin1を得た。第二に、大腸菌に発現させたshootin1を生成し、in vitroにおいてAキナーゼで処理することで、リン酸化されたshootin1を得た。今後、これらのリン酸化shootin1をトリプシン処理し、質量分析を行うことで、リン酸化修飾を受けるアミノ酸残基を明らかにする。Shootin1ノックアウトマウスを作成する。In vivoにおけるshootin1の機能を解析することを目的とし、shootin1ノックアウトマウスに対し、C57BL/6、129の2系統に対して、戻し交配実験を行っている。現在までにどちらの系統に対しても1回の戻し交配を終えたヘテロノックアウトマウスを得ることができた。

我们将分析shootin1 和L1-CAM 之间以及shootin1 和肌动蛋白纤维之间的相互作用是如何通过shootin1 的磷酸化修饰来调节的。我们分析了shootin1与L1-CAM之间以及shootin1与肌动蛋白纤维之间相互作用的控制机制，重点关注shootin1的磷酸化修饰。为了使用质谱法阐明shootin1进行磷酸化修饰的氨基酸残基，我们首先在培养的HEK293T细胞中表达myc标记的shootin1，并用去磷酸化酶抑制剂处理细胞，使用特定的毛喉素处理的细胞培养液进行免疫沉淀。抗myc抗体以获得磷酸化的shootin1。其次，我们生成了在大肠杆菌中表达的shootin1，并在体外用A激酶对其进行处理以获得磷酸化的shootin1。今后，我们将用胰蛋白酶处理这些磷酸化的shootin1，并进行质谱分析，以澄清发生磷酸化的氨基酸残基。创建 Shootin1 基因敲除小鼠。为了分析shootin1在体内的功能，我们正在对C57BL/6和129两品系的shootin1敲除小鼠进行回交实验。迄今为止，我们已经能够在一轮回交后获得两种品系的杂合基因敲除小鼠。