メタンをメタノールに水酸化する生体触媒の活性安定化機構の解明

阐明将甲烷羟基化为甲醇的生物催化剂的活性稳定机制

• 批准号: 19860034
• 负责人: 宮地 輝光
• 金额: $ 1.92万
• 依托单位: Tokyo Institute of Technology
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Young Scientists (Start-up)
• 财政年份: 2007
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2007 至 2008
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-19860034/
• 关键词: メタン水酸化酵素; メタノール脱水素酵素; タンパク哲複合体形成

本研究課題では、(1)膜結合型メタン水酸化酵素(pMMO)と複合体を形成し、pMMOを安定化するタンパク質pMMO-Rの構造と機能を特定し、(2)pMMO-RによるpMMO活性安定化機構を明らかとすることをめざしている。平成19年度は、上記(1)を達成するため以下3つの実験を行った。(1)pMMO-Rの単離精製(2)質量分析法によるアミノ酸配列の決定(3)アミノ酸配列から推測されるタンパク質活性の測定。(1)pMMO-Rの単離精製:メタン酸化細菌を培養し、得られた菌体から各種カラムクロマトグラフィーを用いてpMMO-Rの単離精製を行った。ゲル濾過カラムおよび陰イオン交換カラムによる精製の諸条件を検討し、pMMO-Rを高純度に精製することに成功した。(2)質量分析法によるアミノ酸配列の決定:pMMO-Rのアミノ酸配列は、メタン酸化細菌由来のメタノール脱水素酵素(MDH)と同じであった。(3)タンパク質活性の測定:pMMO-RのMDH活性を確認するため、紫外可視吸光光度計を用いてメタノール酸化活性を測定した。その結果、pMMO-Rはメタノール酸化活性を示すことがわかった。以上の結果から、pMMO-Rは既知タンパク質であり、メタノール酸化活性を示すMDHであることがわかった。これまでに報告されているMDHの構造・機能に関する知見を加味して、MDHがpMMOと複合体を形成することで、如何にしてpMMO活性を安定化しているのかを明らかとすることが今後の課題である。

在本研究项目中，我们将 (1) 鉴定 pMMO-R 的结构和功能，pMMO-R 是一种与膜结合甲烷羟化酶 (pMMO) 形成复合物并稳定 pMMO 的蛋白质，以及 (2) 鉴定 pMMO 的结构和功能-R，一种通过 pMMO-R 稳定 pMMO 的蛋白质 我们的目标是阐明活性稳定机制。 2007年，我们进行了以下三个实验来实现上述（1）。 (1)pMMO-R的分离和纯化(2)通过质谱法确定氨基酸序列(3)测量由氨基酸序列推断的蛋白质活性。 (1)pMMO-R的分离和纯化：培养甲烷氧化细菌，并使用各种柱色谱技术从所得细菌细胞中分离和纯化pMMO-R。我们研究了使用凝胶过滤柱和阴离子交换柱的纯化条件，并成功地将pMMO-R纯化至高纯度。 (2)质谱测定氨基酸序列：pMMO-R的氨基酸序列与源自甲烷氧化菌的甲醇脱氢酶(MDH)相同。 (3)蛋白质活性的测定：为了确认pMMO-R的MDH活性，使用紫外可见分光光度计测定甲醇氧化活性。结果发现pMMO-R表现出甲醇氧化活性。由以上结果可知，pMMO-R是已知的蛋白质，是具有甲醇氧化活性的MDH。考虑到迄今为止已报道的有关 MDH 结构和功能的知识，阐明 MDH 如何通过与 pMMO 形成复合物来稳定 pMMO 活性将是一个挑战。